《植物基因组DNA提取及分子标记技术》实验简介.PDF

《植物基因组DNA提取及分子标记技术》实验简介 一、试验目的 掌握植物基因组DNA 提取的基本方法，了解分子标记技术（以SSR 为例）的基本原理、 步骤以及分子遗传连锁图构建中分子标记的记载方法。 二、原理 （1）CTAB 法提取基因组DNA 原理：CTAB 是一种非离子去污剂。CTAB 与核酸形成复合 物，此复合物在高盐（＞0.7mM ）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1 －0.5 mM NaCl ） 下CTAB －核酸复合物就因浓度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。 经离心弃上清后，CTAB －核酸复合物再用75 ％酒精浸泡可洗脱掉CTAB 。 （2 ）SSR 原理：SSR的基本重复单位是由几个核苷酸组成的，重复次数一般为10-50。同一 类微卫星 DNA 可分布在基因组的不同位置上。由于基本单位单元重复次数的不同，而形成 SSR座位的多态性。每个SSR座位两侧一般是相对保守的单拷贝序列，因此可根据两侧序列 设计一对特异引物来扩增SSR序列。经电泳、显色，比较扩增带的迁移距离，就可知不同个 体在某个SSR座位上的多态性。 GAGAGAGAGAGAGA GAGAGAGAGA GAGAGAGAGAGAGAGAGAGA 电 泳 方 向 三、试验材料 棉花幼嫩叶片 四、器材与试剂 研钵、离心机、1.5mL 离心管、0.2mL 离心管、移液器 （200uL、20uL、10uL）及配套 枪头、PCR 仪，水平电泳槽、电源、凝胶成像系统 抽提缓冲液、裂解液、24 ：1 氯仿/异戊醇、75 ％乙醇、异丙醇、Taq 酶以及反应缓冲液、 Mg2+ 、dNTP、去离子水、矿物油、溴化乙锭、琼脂糖、0.5×TBE缓冲液 五、试验方法与步骤 （一）棉花DNA 提取 1、抽提缓冲液、裂解液的配置 抽提缓冲液 （PH7.5 ）1L： 0.35 M 葡萄糖（69.36 克）；0.1M Tris-HCl （12.44 克）；0.005M Na EDTA （1.86 克）；2%(W/V) 2 PVP K-30 （20 克）0.1% DIECA （2 克） 使用前加β-巯基乙醇至0.2% , PH 调至7.5 。 抽提裂解液(PH 8.0): 1L 0.1M Tris-HCl （12.44 克）；1.4M NaCl （81.816 克）；0.02 M Na EDTA （7.45 克）；2% 2 CTAB （20 克）；0.1% DIECA （1 克）；2% PVP K-30 （20 克） 加0.2% β-巯基乙醇后调PH 值至8.0。 2 、抽提步骤 （1）取幼嫩叶片于研钵中，加预冷的抽提缓冲液，充分迅速研磨。 （2 ）用剪宽了的200uL 枪头将研磨液吸入1.5mL 离心管中，4℃下12000g离心10分钟。 （3 ）取上清至一新的 1.5mL 离心管中，加400uL 预热到65℃的裂解缓冲液,并迅速搅拌均 匀,65℃水浴30 min 。每隔10 min 轻轻摇动一次。 （4 ）加入等体积的氯仿：异戊醇 （24 ：1），轻轻上下颠倒混匀至溶液成一相。 （5 ）室温12000g 离心10 分钟。 （6 ）用剪宽了的200uL 枪头取上清至新管，重新加入等体积的氯仿：异戊醇 （24 ：1），轻 轻摇动直至混匀为一相。 （7 ）室温12000g 离心10 分钟。取上清至新管，加入2/3 体积冰冷的 （-20 ℃）异丙醇，轻 轻上下颠倒混匀，这时会出现絮状的DNA 沉淀。-20 ℃冷冻30 分钟。 （8 ）将DNA 转移至新管，用75%乙醇浸泡来洗盐和去杂