植物的多倍体培养.doc

植物多倍体培养 4月10日起 摘要：植物多倍体是指每个细胞中的染色体数具有3套或更多套数的植物。随着染色体组倍数的增加，有可能使一些作物的经济性状发生有利的变化。因此，植物多倍体的研究和利用是育种工作中值得重视的途径之一。本次实验就是通过用拟南芥种子作为实验材料，通过培育多倍体拟南芥，来熟悉掌握一般的多倍体诱导的方法。 引言 1916年温克勒（H.Winkler）在番茄与龙葵的嫁接试验中发现，在愈伤组织长成的枝条中有番茄的四倍体。自1937年布莱克斯利（A.F.B.lakeslee）和埃弗里（A.G.Avery）利用秋水仙素诱发曼陀罗四倍体获得成功以后，各国相继展开人工诱发多倍体的试验研究。1947年，木原均、西山市三发表《利用三倍体无子西瓜之研究》，报导了三倍体无子西瓜选育成功。1959年，西贞夫等利用四倍体结球甘蓝和四倍体白菜杂交，成功地育成双二倍体新种——“白蓝”。目前，已有1000多种植的获得了多倍体。中国于20世纪50年代开始多倍体育种的研究。70年代以来，蔬菜多倍体育种取得许多重要进展，已培育出三倍体、四倍体西瓜，四倍体甜瓜以及萝卜、番茄、茄子、芦笋、辣椒和黄瓜等蔬菜多倍体材料。 多倍化后，多个等位基因互作产生了更多的组合和更多样的功能变化，从而比二倍体亲本拥有更高的杂合性和更迅速的环境适应力，表现为抗逆性增强及克服远缘杂交的不育性等特点而倍受园艺育种学家的青睐。 多倍化导致植物基因组发生部分或全部的重复，其后伴随着DNA排除、DNA同质化、基因沉默和染色体重排等，从而改变了二倍体祖先基因组中基因连锁关系、遗传平衡及遗传修饰式样赋予多倍体基因组新的细胞遗传学特性,使之在细胞形态、核型特征以及基因表达等方面表现出极大的生物学多样性，从而加速物种的进化。 经典理论认为，植物天然多倍体基因组主要起源于体细胞有丝分裂异常、未减数分裂配子融合和种间杂交三个途径。 目前的研究，特别是2003年拟南芥全基因组测序完成之后，多倍体的认识有了新的概念，像拟南芥这种典型的二倍体植物，基因组极小，但却是一个典型的endopolyploid，在生长过程中存在普遍的基因组多倍化事件，科学家研究认为是基因组的表达需要而使得拟南芥在生长过程中基因组不断的复制自我，因此，自身的基因型以及内源加倍在目前也被认为是多倍体产生的一个重要途径。 人工诱导多倍体的方法很多（在以大蒜根尖多倍体鉴定中）已详细说明，分为物理的（温度剧变、机械损伤、各种射线处理等）和化学方法的（各种植物碱、麻醉剂、植物生长激素等）诱导方法。其中，秋水仙素是诱导多倍体的最有效的方法之一。秋水仙素是从百合科秋水仙素属的一个种，秋水仙（Colchicum autumnale. L.）的器官和种子内提炼出来的一种植物碱。它的化学分子式为C22H25O6N。因有剧毒，故使用时要特别注意，切勿使药液进入眼内或口中。 秋水仙素的作用在于阻止分裂细胞形成纺锤丝，而对染色体的结构和复制无显著影响。浓度适合，药物在细胞中扩散后，不致发生严重的毒害，细胞经一定时期后仍可恢复正常，继续分裂，只是染色体数目加倍成为多倍性细胞，并在此基础上进一步发育成为多倍体植物。 实验材料 试验材料 拟南芥种子 0.1%的秋水仙素，MS培养基[1]，花泥 培养皿，Parafilm封口膜，超净工作台等 实验方法 MS培养基的配置 先配制母液，再按照所需培养基的量，量取所需体积；按照每1000ml 7g、30g的比例加入琼脂和白砂糖。之后，加水至接近所需体积，调节pH至5.8～6.0，然后定容。 消毒处理 种子消毒：选取完整且颗粒饱满的拟南芥种子，先用70%的乙醇在离心管中消毒处理1分钟；在换用2.5%的次氯酸钠溶液处理3分钟；之后立即用清水清洗4-5次。 器具消毒：将培养皿、离心管、移液枪头，以及配置好的MS、所需无菌水、配好的秋水仙素放入手动高温高压灭菌锅[2]中，消毒灭菌。 铺板 将消好毒的种子放入离心管中，加入悬浮液（0.3%～0.5%的琼脂溶液），此时拟南芥种子会悬浮在液体中，用移液枪吸取种子，均匀的涂抹在培养板上。然后将培养板一道22℃的有光培养室中培养。 不同处理诱导多倍体 表1：处理方法 编号 培养基 处理方法 A 纯MS培养基 铺板后，正常培养； B 纯MS培养基+0.1% 秋水仙素 铺板后，正常培养15天，将所得幼苗分别移入两个纯MS培养板上B1、B2，继续培养； C 0.1%秋水仙素的水溶液 铺板后，在处理1、2、3、4天后，分别取一部份种子移入新的纯MS培养基上，编号为C1、C2、C3、C4，继续培养； D 清水 铺板后，处理1、2天后，分别取一部份种子移入新的纯MS培养基上，编号为D1、D2。 移苗 在处理的幼苗长到四叶期（一半需要两周左右）时，准备花泥，将幼苗移入花泥中继续培养。移