温氏附红细胞体病PCR诊断方法的建立及其应用.pdfVIP

第26卷第6期 华 中 农 业 大 学 学 报 Vo1．26 No．6 2007年 l2月 Journal of Huazhong Agricultural University Dec．2007。8l7～82l 温氏附红细胞体病PC R诊断方法的建立及其应用 李树清D 杜 凯 。’ 胡永强D 陈声国 。’ 陈志飞D 周艳琴。’ 赵俊龙 。 (”上海出入境检验检疫局，上海200135； ’华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，武汉430070； 。 华中农业大学动物医学院，武汉430070) 摘要 为建立特异、敏感、快速的温氏附红细胞体诊断方法，根据温氏附红细胞体 16S rRNA基因序列 (GenBank登录号为AY946266)，设计l对种特异性引物，建立了温氏附红细胞体的PCR诊断方法。特异性试 验和敏感性试验结果表明，该方法能特异性地扩增温氏附红细胞体16S rRNA基因序列的特异性片段，检测温 氏附红细胞体最低DNA量为0．178 。利用该方法对湖北省、江苏省和黑龙江省温氏附红细胞体病感染情况 进行了流行病学调查，结果显示阳性感染率分别为10．3 、5．3 、45．8 ，说明温氏附红细胞体在湖北省、江苏 省和黑龙江省均存在，流行病学调查显示湖北省感染率较高、流行较广。 关键词 温氏附红细胞体；PCR；16S rRNA；应用 中图法分类号 S 855．9 9：S 854．4 3 文献标识码 A 文章编号 1000-2421(2007)06—0817—05 附红细胞体病(eperythrozoonosis)是由附红细 作为确诊标准[7 ]。因此，笔者根据温氏附红细胞体 胞体(Eperythrozoon)寄生于人畜红细胞表面、血浆 16S rRNA基因序列设计了1对种特异性引物，建 和骨髓而引起的一种人畜共患病[1]。该病原体的分 立了PCR诊断方法，并利用该方法对湖北省、江苏 类学地位目前仍有争议。过去将附红细胞体和血巴 省和黑龙江省牛附红细胞体感染情况作了流行病学 尔通氏体(Haernobartonella)归属于立克次氏体目 调查。 (Rickettsalies)，无浆体科(Anaplasmataceae)，但近 1 材料与方法 年来一些学者对不同动物来源的附红细胞体的 16S rRNA基因进行了系统发育分析，结果表明附红 1．1 临床样品及主要试剂 细胞体和血巴尔通氏体与立克次氏体亲缘关系较 在湖北省武汉、大冶、红安、麻城、孝感，江苏省 远，而与支原体的亲缘关系较近[24]。 昆山、苏州，黑龙江省哈尔滨等地无菌颈静脉采集临 温氏附红细胞体(Eperythrozoon wenyonii，简 床血样333份，用3．8 9／6枸橼酸钠抗凝后带回实验 称E wenyonii)是附着于牛的红细胞或游离于胞浆 室，作为临床检测样品。在武汉采集的临床样品中 的一种血营养菌(Haemotrophic bacteria)L5]。我国 奶牛76头，黄牛15头，在大冶、红安、孝感采集的临 温氏附红细胞体病最早于1982年由张汝勇首先报 床样品均为水牛，在麻城采集的临床样品为澳大利 道。近年来该病的发生和报道日渐增多，给我国畜 亚矮角牛，江苏省和哈尔滨市采集的临床样品均为 牧业造成一定的损失[6]。到目前为止，附红细胞体 奶牛。 还不能体外培养。实验室诊断方法主要是通过显微 溶菌酶购自武汉凌飞科技有限公司；蛋白酶K 镜检，但是显微镜检法容易和其它原虫或染色颗粒 购自 Merck公司；TaqDNA聚合酶、dNTP和 等混淆而造成假阳性，且敏感性不高。由于抗原制 PMDl8一T载体为宝生物工程(大连)有限公司产品。 备方法不佳及抗体消长规律性不强，而且不能鉴别 1．2 阳性质粒及对照病原 急性感染，造成血清学方法仅能作为定性依据，不能 E．wenyonii阳性质粒为笔者所在实验室保存， 收稿日期：2007—06—14 *上海市科委标准专项(O4 5O17)资助 **通讯作者