内参基因加标法定量土壤微生物目标基因绝对拷贝数.PDF

微生物学通报 Feb. 20, 2016, 43(2): 424−433 Microbiology China /wswxtbcn tongbao@ DOI: 10.13344/j.microbiol.china.150702 生物实验室 内参基因加标法定量土壤微生物目标基因绝对拷贝数 1,2 1 2* 王行 曹萍麟 张志剑 (1. 国家高原湿地研究中心 西南林业大学 云南 昆明 650224) (2. 浙江大学 环境科学研究所 环境与资源学院 浙江 杭州 310058) 摘 要：【目的】通过荧光定量PCR 技术对土壤微生物目标基因进行绝对定量，其定量结果的准 确性容易受到 DNA 提取得率以及腐殖酸抑制性的影响。【方法】采用内参基因加标法，利用构 建的突变质粒DNA ，对供试水稻土壤样品中的微生物16S rRNA 目标基因的绝对拷贝数进行荧 光定量PCR 检测，用来表征该样品中细菌群落总体丰度。在定量前通过双向引物扩增方法验证 突变质粒中的内参基因对供试土壤的特异性。【结果】不同水稻土壤样品的DNA 提取量在样品 间差异较大。通过内参基因加标法对DNA 提取量进行校正，显著提高了 16S rRNA 基因绝对定 量的精确度。不同水稻土壤样品间的变异系数为17.8，与未加标处理相比降低了66.7%。在此基 础上，进一步通过内参基因加标法对土壤有机质和含水率均呈现典型空间特征差异的6 处亚热带 湿地土壤样品中的16S rRNA 基因进行绝对定量。16S rRNA 基因绝对拷贝数与土壤微生物生物 量碳具有显著的线性相关性(R2=0.694 ，P0.001) ，表明内参校正后的16S rRNA 基因绝对拷贝数 可以准确反映单位质量土壤中微生物的丰度。【结论】内参基因加标法可以对DNA 提取得率以 及腐殖酸对 PCR 扩增的抑制性进行校正，从而提高绝对定量的准确性。基于内参基因加标法的 目标基因绝对定量PCR 检测，可作为土壤微生物生物量测量，以及微生物功能基因绝对丰度定 量的一种核酸检测方法。 关键词：土壤，含水率，DNA 得率，定量PCR ，绝对定量，内参基因，腐殖酸抑制 The absolute PCR quantification of microbial target genes in soils using internal gene as standards WANG Hang1,2 CAO Ping-Lin1 ZHANG Zhi-Jian2* (1. National Plateau Wetlands Research Center, Southwest Forestry University, Kunming, Yunnan 650224, China) (2. Institute for Environmental Science, College of Environmental Resource Sciences, Zhejiang University, Hangzhou, Zhejiang 310058, China) Abstract: [Objective] Fluorescence quantitative PCR can absolutely or relatively quantify the target genes in soil samples. However, the accuracies of absolute quantification of targe