猪传染性胸膜肺炎快速诊断方法.pdfVIP

第31卷第5期 南昌大学学报(理科版) Vo1．3l No．5 2007年l0月 Journal of Nanehang University(Natural Science) Oct．2哟7 文章编号：1006—0464(2007)05—0490—03 猪传染性胸膜肺炎快速诊断方法 朱必凤，杨旭夫，彭 凌，刘 主，苏杰浩 (韶关学院英东生物工程学院，广东韶关 512005) 摘 要：针对猪胸膜肺炎放线杆菌的外膜脂蛋白(omlA)基因序列设计了1对特异性引物，研究了猪胸膜肺炎PCR 诊断方法；探索了DNA的快速提取方法、PCR反应最适条件、特异性和灵敏度。结果显示：猪胸膜肺炎的6个分离 株均能扩增出1个960 bp特异性条带，而对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的扩增结果为阴性；高浓度副猪嗜血杆菌6 个分离株的菌液虽然有扩增产物，但是电泳谱带与猪胸膜肺炎明显不同。灵敏度测试表明，APP菌液最低检出浓 度为7．7×105个／mL。该方法有望成为应用于猪传染性炎的快速诊断和流行病学调查的新方法。 关键词：猪胸膜肺炎放线杆菌；胸膜肺炎放线杆菌；PCR；诊断汐 膜脂蛋白基因 中图分类号：S852．61 文献标识码：A 猪传染性胸膜肺炎(porcine infectious pleuro— 通过培养特性和一系列的生化特性鉴定，费时费 pneumonia)是 由 猪 胸 膜 肺 炎 放 线 杆 菌 力 。随着分子生物学的迅速发展，分子生物学技 (Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的一 术在各学科的渗透和广泛应用，国内外应用PCR方 种以急性出血性胸膜肺炎和慢性纤维素性坏死性胸 法对猪胸膜肺炎放线杆菌的检测和血清型分型已成 膜炎为特征的呼吸系统传染病。1957年英国首次 为研究热点 应用PCR技术对猪胸膜肺炎放线 报道该病。随着养猪业集约化的发展，该病在美洲， 杆菌进行了研究，为猪传染性胸膜肺炎的快速诊断 欧洲和亚洲一些国家和地区陆续有所报道，且有逐 和流行病学调查提供方法。 年增长的趋势，目前已经成为世界性疾病。在我国， 1 材 料 1990年杨旭夫等通过病原菌的分离鉴定、血清学分 型和人工复制疾病等首次确定了该病在我国猪群的 1．1 菌 株 存在和流行¨J。高林等在1994年进行的调查表明， 猪胸膜肺炎放线杆菌从广东某养猪场分离，经 该病在我国规模化猪场的感发率日益增高 J。该 传统方法鉴定后，选出6个分离株作为研究样品，分 病急性型表现为患病猪很快死亡，慢性型猪生长缓 另0为APP—a、APP—b、APP一4、APP一5—1、APP一 慢，严重影响饲料报酬。该病现已成为危害养猪业 10 和 APP一11株 副猪嗜血杆菌6个分离株1—9、 最严重的疾病之一。 279p、1—1、4—1P、4—2p和4—5p株，从韶关市某 本病主要靠病原菌的分离鉴定和血清学试验做 猪场分离。金黄色葡萄球菌和大肠杆菌由本校微生 出确切诊断。由于肺脏和气管中有其他细菌，虽然 物实验室提供。 分离时依据菌落形态及革兰氏染色可以排除一些杂 1．2 PCR扩增引物 菌，但最终确定还需经生化鉴定、病原学试验或免疫 针对猪胸膜肺炎放线杆菌的外膜脂蛋白(on— 学试验。然而，由于该病的病原菌有生物I型和生 lA)基因序列 了上下游各l8个bp，上游引物：5’ 物Ⅱ型，仅生物I型就已经发现有13个血清型，虽 一 GTT GAT ATG TCC GCA CCA一3’，下游引物：5’ 然各血清型之间