分子信标技术及其应用研究进展-北京大学单分子与纳米生物学实验室.PDF

分子信标技术及 其应用 研究进展 组员：马晓雯 李艳丽 鲁涛 蒋昱萌 分子信标简介 1996年，Tyagi和Krammer设计了一 种可以特异性识别核酸序列的新型 荧光探针,这种荧光探针通过与核酸 靶分子进行杂交后发生构象的变化 而发出荧光,他们将其命名为分子信 标(Molecular Beacon)。 分子信标简介 分子信标具有背景信号低,灵敏 度高、特异识别性强、操作简 单，不必与未反应的探针分离即 可实时检测，可用于活体分析等 优点。 分子信标简介 在生物化学分析，生物医 学研究和临床诊断中有着 广泛的应用价值。 主要内容 分子信标的结构 分子信标的作用原理 影响分子信标的主要因素 新型分子信标 分子信标的应用 前景与展望 分子信标的结构 （1）环状区 （2）信标茎杆区 （3）荧光基团和淬灭 基团 环状区 猝灭基团 茎杆区 荧光基团 首例分子信标结构示意图 分子信标作用原理 无靶标存在下，茎环结构使得荧光基团和 猝灭基团相互靠近，发生荧光共振能量转移 （FRET），荧光淬灭，荧光背景极低。 加入靶序列后，分子信标与完全互补靶序 列形成刚性并且更加稳定的双链杂交体，使 得荧光基团和淬灭基团距离增大，阻止了 FRET的发生，荧光恢复。 影响分子信标的主要因素 结构因素 温度因素 环境pH 因素 分子信标的纯度 影响分子信标的主要因素 结构因素： 探针序列比茎干区序列长两倍以上 过长——发夹结构过于稳定——假阴性 过短——发卡结构不稳定——假阳性 影响分子信标的主要因素 温度因素： 较低温度——稳定的发夹结构 较高温度——破坏发夹结构 影响分子信标的主要因素 环境pH 因素： pH过高时，茎干区碱基对之间的稳 定结合被破坏，分子信标变性，荧光 基团与淬灭基团分开产生荧光。 影响分子信标的主要因素 分子信标的纯度也是影响其 检测能力的重要因素。 分子信标的设计 序列长度 茎杆序列中G和C的含量不能太高 由于被测对象DNA或RNA是大分子，存在扭曲 现象，因此要选择容易接近的那段序列即被 测对象的外围碱基序列来设计信标。 分子信标的设计 荧光淬灭依赖的是能量共 振转移,而转移的效率与荧光 基团发射光谱同淬灭基团激 发光谱的重叠有关。 符合此要求且较常用的荧光剂-淬灭剂有: EDANS（5′- (2′-氨乙基氨基奈-1-磺酸)和 DABCYL（4′-(4′-二甲基氨基叠氮苯) 苯甲酸 6-荧光素和DABCYL 荧光素和罗丹明、 荧光素和芘丁酸 香豆素和乙锭 荧光素和伊红 一些铽螯合物和四甲罗丹明 等等。 分子信标的表面固定 1999年Tan等首次通过生物 素-抗生物素蛋白将分子信标固 定在光纤表面，然后将光纤浸入 含需检测的靶序列的溶液中，同 时由光纤导入激光，实现了单分 子检测。 分子信标的表面固定 固定分子信标的方法为分子信标生物传 感器及分子信标生物芯片的研究奠定了 基础,也使分子信标更广泛地应用于生物 体系。 新型的分子信标 波长转移分子信标 优点： 如果对不同分子信标探针修饰以具有不同特征发射波长的荧光发射