一株高产脯氨酸的嗜醋酸棒杆菌的选育及发酵条件优化.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，３０（１１）：７０７４ ? 一株高产脯氨酸的嗜醋酸棒杆菌的 选育及发酵条件优化 １ １，２ 卢伟宁 　廖瑜玲 （１广东肇庆星湖生物科技股份有限公司　肇庆　５２６０４０　２华南理工大学生物科学与工程学院　广州　５１０００６） 摘要　以嗜醋酸棒杆菌为出发菌株，经过片段化全基因组体外诱变、重组和连续的磺胺胍抗性筛 选，获得一株Ｌ脯氨酸的高产菌株。摇瓶发酵优化结果表明，葡萄糖、生物素和硫胺素的最适用 量分别为１６％、３００ｇ／Ｌ、４００ｇ／Ｌ，最适ｐＨ为６．８～７．０，装液量为２５ｍｌ／５００ｍｌ摇瓶，发酵培养 μ μ ７２ｈ后Ｌ脯氨酸产率高达到７５．６ｇ／Ｌ，与对照相比提高了５％。考察了５０Ｌ发酵罐中细胞生长对 Ｌ脯氨酸产量的影响，补料分批发酵结果表明（比生长速率分别为０．０６／ｈ、０．０８／ｈ和０．１／ｈ），比 生长速率在０．０８／ｈ左右时Ｌ脯氨酸的产率最高，Ｌ脯氨酸的比生产速率Ｑ 达到０．０９１ｇ／（ｇ． Ｐ ｈ），产率高达８２．１ｇ／Ｌ，比优化前提高了１４％。 关键词　Ｌ脯氨酸　体外诱变　电转化 发酵优化　补料分批发酵 中图分类号　Ｑ７８６ 　　Ｌ脯氨酸是合成人体蛋白质的２０种重要氨基酸之 外线处理ＤＮＡ使其发生突变，然后采用超声波将 ＤＮＡ 一，是一种含有亚氨基的中性氨基酸，在医药、农业、化工 片段化，片段化的ＤＮＡ电转化到嗜醋酸棒杆菌中，结合 及食品等方面有着广泛的用途。在医药方面，Ｌ脯氨酸 药物选育抗反馈调节的Ｌ脯氨酸高产突变株。 可用于配制治疗肝病的氨基酸输液；在化工方面，Ｌ脯氨 １　材料与方法 酸及其衍生物可作为催化剂使用。以往，Ｌ脯氨酸的制 备采用明胶水解法，目前大规模的Ｌ脯氨酸生产主要通 １．１　供试菌种与培养基 ［１４］ ［５］ 过微生物菌株发酵 。Ｙｏｓｈｉｎａｇａ等 最先报道了利用 　　嗜醋酸棒杆菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）， 黄色短杆菌（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）的异亮氨酸缺陷型突 由广东肇庆星湖生物科技股份有限公司提供。菌株培 变株发酵产生Ｌ脯氨酸，产量达到１２ｇ／Ｌ。此外，用于Ｌ 养所需的主要培养基（ｇ／Ｌ）包括完全培养基（葡萄糖 脯氨酸生产的突变株还包括组氨酸缺陷的黄色短杆菌 ５、牛肉膏１０、蛋白胨 １０、ＮａＣｌ５、ｐＨ７．０）、斜面培养基 （Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）、苯丙氨酸和色氨酸缺陷的栖糖 （葡萄糖１０、蛋白胨１０、牛肉膏１０、酵母膏５、ＮａＣｌ５、ｐＨ 蜜棒杆菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）、异亮氨酸缺陷的 ７．０）、种子培养基［葡萄糖２０、（ＮＨ）ＳＯ ５、玉米浆 ４ ２ ４ 谷氨酸棒杆菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、库尔特氏杆 １０％ （体积比）、ＫＨＰＯ １、ＭｇＳＯ ·７ＨＯ０．４、ｐＨ７． ２ ４ ４ ２ ［６］ ［１］ ０］、发酵培养基［葡萄糖 １４０、（ＮＨ）ＳＯ １０、玉米浆 菌属的缺陷株（Ｋｕｒｔｈｉａｃａｔｅｎａｆｏｒｍａ）等 。张伟国 以 ４ ２ ４ 嗜