落刺激因子的复性并同时纯化.PDF

西北大学学报( 自然科学网络版) 2006 年 3 月，第 4 卷，第 2 期 Science Journal of Northwest University Online Mar. 2006, Vol.4, No. 2 强阴离子交换色谱法对重组人粒细胞- 巨噬细胞集 落刺激因子的复性并同时纯化 刘建波，白 泉，王骊丽，耿信笃 （西北大学现代分离科学研究所/现代分离科学陕西省重点实验室，陕西 西安，710069 ） 摘 要: 采用强阴离子交换色谱(SAX)对由 E.coli 表达的重组人粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子 （rhGM-CSF ）复性与同时纯化工艺进行了研究。分别讨论了流动相pH 、在流动相中添加不同比 例的GSSG/GSH 以及不同浓度的脲对rhGM-CSF 复性与同时纯化的影响。结果表明：三者对其复 性效率和质量回收率均有较大的影响；GSSG/GSH 可有效提高rhGM-CSF 二硫键的正确对接和复 性效率，而低浓度的脲则可有效抑制蛋白沉淀，可大大提高质量回收率。在最优化条件下，SAX 7 IU/mg 在 30 min 内一步可使 rhGM-CSF 在分离纯化的同时进行复性，其比活为 1.66×10 (IU/mg=1.666 7 mol/(s·kg)) ，质量回收率为58.8% ，纯度可达96.2%。 关 键 词: 离子交换色谱；蛋白复性；纯化；重组人粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子 中图分类号：O652.63 文献标识码：A 文章编号：1000-274X(2006)0201-010 人粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)是调节造血前体细胞生长和分化的主要细胞因子，可促 进中性粒细胞和巨噬细胞的增加，增强造血功能[1] 。在临床上，rhGM-CSF 主要用于治疗各种原因引起的 [2] 周期性白细胞减少症、先天性白细胞减少症、再生障碍性贫血等 。 大肠杆菌（E.coli ）表达的 rhGM-CSF 由于疏水性很强，形成了难溶于水的包涵体，只有加入高浓度 的变性剂，如 7.0 mol/L 盐酸胍(GuaHCl)或 8.0 mol/L 脲才能将其溶解。变性的 rhGM-CSF 没有生物活性， 首先必须对其进行复性，然后再进行分离纯化。采用稀释法或透析法对 rhGM-CSF 进行复性，其活性和质 量回收率较低。目前报道的复性和纯化方法绝大多数是几种色谱方法和稀释法的组和[3~6]，如用 7.0 mol/L 盐酸胍溶解 rhGM-CSF 包涵体，然后用凝胶色谱复性[6]，用固定化金属离子亲和色谱纯化后再用离子交换 色谱进一步纯化，纯化后的 rhGM-CSF 再用醋酸钠缓冲液透析，所得 rhGM-CSF 纯度为 97%，但质量回收 率仅为 33.2% 。这些方法都可以得到较高纯度的 rhGM-CSF ，但缺点是步骤多，复性效率低，通常质量回 收率仅为 30%~40% 。 作者之一早在 10 年前就提出用疏水色谱(High performance hydrophobic interaction chromatography, HPHIC)对变性蛋白复性及同时纯化的方法[7]，可在数十分钟内一步完成除去变性剂、使变性蛋白复性、分 离目标蛋白和杂蛋白，并对其折叠机理进行了详细地研究[8, 9]，现成功地将其应用于基因工程产品重组人 [10] [11] 干扰素-γ(rhINF-γ) 、重组人胰岛素原（rh-proinsulin ） 的复性和同时纯化工艺中，取得了良好的效果， 活性回收率是以往方法的 2~3 倍。最近，将强阴离子交换色谱(strong anion exchange chromatography, SAX) 用于重组人粒细胞集落刺激因