三、原理.doc

Experiment 2 革蘭氏染色及簡單染色 一.前言 微生物體型很小，菌體多為透明無色，若將為生物製成懸浮液，置於顯微鏡底下時，通常僅能看見輪廓或細胞內較明顯的器官，不易與背景﹝水﹞有所區別，對微生物構造及特性的瞭解因此受到控制。所以我們利用染色後，微生物細胞與周圍環境對比效果就會增加，更易於檢視其大小、形狀、排列情形，亦可更進一步鑑別不同微生物菌體的型態及結構，例如細胞壁、液泡或核質等細胞器官。 二.目的:使微生物和環境對比增強，易於檢視或進一步作菌種鑑定。 簡單染色法﹝Simple stain﹞ 瞭解微生物染色處理 學習染劑如何配製 熟悉簡單染色法的原理、實驗步驟與適用時機 瞭解簡單染色法在環工上的意義 革蘭氏染色法﹝Gram stain﹞ 瞭解鑑別染色法的原理與適用時機 熟悉革蘭氏染色法的原理、實驗步驟與染色結果 配置革蘭氏染色法之四種染劑 瞭解革蘭氏染色法在環工上的意義 三.原理 簡單染色法之原理： 簡單染色法的原理主要是細胞表面或細胞內活化位置﹝active site﹞與染料分子產生物理作用與化學反應。每種染料對特定的細胞物質都有特殊的親和力，舉例而言，細胞中的蛋白質、核酸會分解氨基酸，並可在鹼性溶液中形成帶陰電的原子團與陽電荷鈉離子或鉀離子鹽類。此鹽類可與帶陽電荷的鹼性染劑﹝如甲烯藍﹞產生離子交換現象： (Na)+(細胞蛋白質或核酸)- + (甲烯藍)+(Cl)- (甲烯藍)+(細胞蛋白質或核酸)- + (Na)+(Cl)- 革蘭氏染色法之原理： 革蘭氏染色法的原理主要是利用僅存於革蘭氏陽性菌的核醣核酸鎂鹽-蛋白質-醣類複合物﹝Mg ribonucleic acid-protein-carbohydrate complex﹞﹝革蘭氏陰性菌體中不存在此物質﹞與染劑間的作用，此複合物會與染劑中的結晶及碘分子形成一種無法被酒精及水所溶解的物質，保留了複合物的生成。另就細胞化學結構分析，革蘭氏陽性菌的細胞壁單層且較厚，所含的脂質﹝lipid﹞較少。 染色步驟中以乙醇脫色處理時，細胞壁會形成脫水現象，滲透降低，使結晶紫-碘的複合物(CV-I)留於細胞質中無法溶出，仍保持紫色。而革蘭氏陰性菌為多層且薄，使用乙醇處理染色時，會將細胞壁的脂質溶解，使壁的孔隙變大，滲透性增加很快溶出結晶紫-碘複合物，由次可區別陽性與陰性細胞 四.實驗器材及儀器 1.載玻片 2.蓋玻片 3.酒精燈 4.塑膠滴管 5.拭鏡紙(吸水用) 6.洗滌瓶 7.光學顯微鏡  五.菌種或採樣來源 枯草桿菌﹝Bacillus subtilis﹞ 大腸桿菌﹝Escherichia coli﹞ 未知溶液 六.實驗步驟 簡單染色法 Step1：由液體培養基取樣：以過火滅菌完成之接種環沾取一環 的菌液均勻塗抹於乾淨的戴玻片上。 【技巧】為避免染劑無法滲入，接種環取樣時不要沾取 過多的菌落﹝液﹞，以避免塗抹太厚的菌落﹝液﹞於載 玻片上；同時戴玻片上之菌液應力求均勻。 Step3：將以塗抹微生物之玻片標本置於室溫下自然乾燥之。 Step4：進行固定，固定可用兩種方法：用火固定或用藥固定， 用火固定是將塗抹面向上的戴玻片快速通過火焰幾次； 而用藥固定則是在塗抹面上滴入醇醚混合物或木精 ﹝甲醇﹞，任其揮發乾燥即得。一般實驗室可用酒精燈 ﹝或本生燈﹞之火焰固定較為方便，惟應注意加熱時戴 玻片玻璃會傳熱，應避免燙傷。 Strp5：滴加適量的甲烯藍染液於載玻片上，使其全部蓋滿，經 過1分鐘後，再以蒸餾水洗去剩餘染劑。 Step6：將染色完成的標本以吸水紙輕輕地吸乾水分，待其乾燥 後，蓋上蓋玻片，以顯微鏡觀察之。觀察時應詳細繪圖 與紀錄微生物的基本外型、菌體排列狀態等等特徵。 革蘭氏染色法 Step1：取樣與塗抹：其作法與單染法相同，若取口腔上皮細胞 則應以乾淨牙籤刮取，並均勻塗抹於戴玻片上。 【技巧】取樣時使用培養18~24小時的微生物為佳，取樣 時避免沾取過多的菌液以致菌液﹝落﹞太厚，染劑無法 滲入。 Step2：乾燥：將以塗抹微生物之玻片標本置於室溫下自然乾燥 ﹝陰乾﹞之。 Step3：過火固定：將塗抹面向上的戴玻片快速通過火焰幾次。 操作時注意加熱玻璃會傳熱，應避免燙傷。 Step4：染色一：將戴玻片斜置於染色架上﹝若沒有染色架可直 接用手握戴玻片﹞，滴加結晶紫染劑於戴玻片上，使其 全部蓋滿，戴玻片下用1000ml燒杯承