蚕病学实验指导.doc

《蚕病学》实验指导 实验 病毒病实验 一、实验目的认识家蚕血液型脓病、中肠型脓病、浓核病等三种主要病毒病的病征，主要组织器官的病理变化，从而掌握病毒病的识别与检验技术。二、实验材料及仪器1、试验材料：健康活蚕、病毒病活蚕、病毒病蚕浸渍标本、1N NaOH、1N HCl、酒精乙醚混合液、苏丹Ⅲ染色液（将0.5克苏丹Ⅲ溶于100ml 95%的乙醇中，过滤）、蒸馏水等。2、仪器及用品：显微镜、载玻片、盖玻片、玻璃棒、剪刀、镊子、培养皿、酒精灯、昆虫针、塑料盘、火柴等。三、实验内容与方法（一）血液型脓病（核型多角体病）1、血液型脓病的病征观察病蚕患病初期无明显病征，病重者则表现出各种显著病征。典型病征表现为：体壁紧张发亮，显示出乳白色；行动狂燥，常爬行于蚕座四周；最后体壁破裂，流出乳白色脓汁而死。由于不同时期发病，表现为不眠蚕、高节蚕、脓蚕、斑蚕等。 2、血液型脓病蚕的组织病理检查（1）血液 用解剖剪剪去病蚕尾角或腹足，鉴别流出血液的颜色（病蚕血液呈乳白色）。取此血液1滴于载玻片上，盖上盖玻片，在400~600倍显微镜下进行镜检。仔细观察血液中血球的病理变化，以及多角体的形态。多角体多为六角、四角或三角形的折光性较强的多面结晶体，一般以六角形为多，较为整齐，大小（直径）为2～6微米。由于脂肪组织被破坏，脂肪球游离于血液中，因此，镜检时，视野中常因脂肪球与多角体相混淆而难以区别，故镜检时可用下列三个方法来加以区别。①物理性状差异比较法根据脂肪球与多角体的比重、折光性、形态大小的不同。多角体比重大于脂肪球，所以临床标本稍停片刻后，脂肪球往往都浮于上层，多角体多沉于下层，可分为两个焦平面。同时多角体的折光性比脂肪球强，其大小亦较整齐，镜检时采光不宜太强。②苏丹Ⅲ（Sudan Ⅲ）染色法取少量病蚕血液涂片，待干，滴加1滴苏丹Ⅲ染色液，待干，滴加1滴蒸馏水，盖上盖玻片，在400~600倍显微镜下进行镜检，在视野中呈红色或橙黄色的圆球状物质是脂肪球，多角体则不着色。③有机溶剂溶解法取1滴病蚕血液制成血液涂片，干燥后在血液涂片上加1滴酒精与乙醚的等量混合液，待混合液蒸发完后加蒸馏水1滴，盖上盖玻片，在400~600倍显微镜下镜检。脂肪球因被有机溶剂溶解而在视野中消失，多角体则依然存在。（2）真皮细胞 取病蚕体壁真皮层一小块（1～2mm），置载玻片上，加蒸馏水1滴，盖上盖玻片（不要重压）在400～600倍显微镜下进行镜检。可清楚地见到由于病毒寄生，细胞核充满了多角体而显得特别膨大（最后，细胞破裂，多角体进入血液，故本病蚕的体壁很易破裂）。 （二）中肠型脓病（质型多角体病）1、中肠型脓病的病征观察本病的病情发展较缓慢，病程较长，病蚕可以带病维持相当长的时间才陆续死亡。发病期以大蚕为多。小蚕感染后，蚕体发育显著不齐，病蚕体躯瘦小，常伏于蚕座四周或残桑中，大蚕感染本病时，表现为体色灰白发暗，常静伏于蚕座，胸部半透明，呈所谓的空头症状，毙死前在第五腹节背面，也往往可以透视出黄白色或白色的病状，肛门周围往往有稀粪，蚕座污染严重，重病时常有乳白色粘液排出。2、中肠型脓病的病理检查（1）肠液与蚕粪 本病蚕常伴有下痢，粪形不正，常有乳白色粘液排出，轻者没有。用手挤压病蚕尾部，把从肛门挤出的蚕粪及肠液粘于载玻片上（可加少许无菌水调匀），盖上盖玻片，在600倍显微镜下进行镜检，即能检到多角体。此多角体与血液型脓病多角体的主要区别是全形扁小，直径0.5～1.0微米，大小开差显著，常呈四角、三角形。在本病蚕的血液内则检不到病毒多角体。（2）消化管 用解剖剪从病蚕背中线剖开，在无解剖器时，可直接用手指将病蚕体壁撕开。可见中肠后部有乳白色横绉，随着病势的发展，乳白色病变部分向前延伸，最后可及全部中肠。观察时，剪取中肠后部组织一小块，放在载玻片上，加上无菌水少许，用盖玻片轻轻加压，压碎组织后，在400～600倍显微镜下，可见到病毒多角体。（三）浓核病1、浓核病病症观察家蚕初感染浓核病病毒后，一般当龄无明显症状，约3日后出现食桑减少，发育不良、迟眠、特小蚕等症状。7日后很少进食，消化管内无桑叶碎片，充满黄褐色液体，外观明显空头、空身。龄初发病表现为起缩、下痢，体色灰黄不转青白，体壁多皱；龄末发病常爬至蚕座四周，头胸昂起，迟迟不眠，全身半透明。严重时排泄黄褐色（酱油色）稀粪或污液，口吐肠液，不久死亡。死后尸体软化扁瘪，体内细菌大量繁殖引起继发性败血症而导致尸体发黑腐烂。群体表现为发育缓慢、大小不齐，眠起不齐等与细胞质型多角体病相似的症状。2、浓核病病理检查（1）肠液 用手挤压本病蚕胸部，肉眼观察其从口中吐出的肠液，其颜色由正常蚕的黄绿色变为褐色。然后沾取肠液及排泄液作临时标本，在400～600倍显微镜下检查，无病毒多角体而有大量细菌