荧光介绍及荧光显微镜的使用.ppt

一、荧光显微镜的使用 优点： 检出能力高 对细胞的刺激小 能进行多重染色 用途： 物体构造的观察 荧光的有无、色调比较进行物质判别 发荧光量的测定对物质定性、定量分析 什么是荧光 ? 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。 即：物质吸收短波光，发射出的长波光。 一种光化荧光 荧光的种类 荧光的性质 吸收光 保持固有的荧光特性 荧光波长＞激发波长 荧光强度极小于激发光的强度 有不同程度的衰减 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率 荧光显微镜的种类 透射式 落射式 荧光显微镜的主要部件 透射式 汞灯光源 激发滤色镜 暗场聚光镜 吸收滤色镜 落射荧光显微镜原理 透射荧光显微镜原理 荧光显微镜标本制作要求 （一）载玻片 　　载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。 （二）盖玻片 　　盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。 　　（三）标本 　　组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不充分激发。另外，细胞重迭或杂质掩盖，影响判断。 　　（四）封裱剂 　　封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.5～9.5时较亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。 　　（五）镜油 　　一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用特制的无荧光镜油，也可用上述甘油代替。 二、可见光显微镜的使用 光源在显微镜下方，不需要开汞灯 可以观察载玻片上的任何物质 三、成象系统 1、照相机 2、图象采集软件 Leica100图象分析软件，把显微镜下看到的图象拍摄下来，保存成图片文件，再进行相关分析。 使用要点 标本制作 正确选择滤色镜 200W的超高压汞灯作光源 ，需预热15分。寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。 防止污染（载物台已被EB污染） 染色后尽快观察，荧光逐渐减弱 测试题 1、该仪器由哪几部分组成？ 2、什么是荧光？荧光有几种类型？有什么性 质？ 3、该仪器的使用要点有哪些？ 4、荧光显微镜分哪两种？ * 荧光介绍及荧光显微镜的使用 Leica 图象分析仪 组成部分 显微镜 荧光显微镜 可见光显微镜 成象系统 照相机 图象采集软件 自发荧光：物质受光激发产生的固有荧光 二次荧光：物质借荧光色素受光激发产生的荧光 自发荧光 二次荧光 落射式 汞灯光源 激发滤色镜 分色镜 吸收滤色镜 汞 灯 激发滤色镜 分色镜 吸收滤色镜 物 镜 标 本 目镜 吸收滤色镜 物镜 暗场聚光镜 激发滤色镜 汞灯 荧光激发滤色块 透过能使标本产生荧光的特定波长的光，同时阻挡对激发荧光无关的光。 几种主要的荧光激发滤色块 单细胞悬 液制备 制胶片 DNA碱解旋 电泳 中和 细胞裂解 染色与观察 单细胞凝胶电泳试验（彗星试验） 对照组与实验组中肺泡巨噬细胞DNA迁移的实验图象 DAPI+FITC+Texas Red * Sheet3 Sheet2 Sheet1 激发方法 代号 主波长 紫 V 405nm 兰 B，B2 495nm 绿 G 546nm