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一种新型利用DSS交联剂避免重链轻链干扰免疫沉淀技术 　　摘 要 抗体是含有4条多肽链的对称结构，其中两条较长的相对分子量较大的为重链，大小为55KDa，另外两条较短的相对分子量较小的为轻链，大小25KDa。在免疫沉淀技术中如果目的条带大小和重链轻链的大小一样或接近将影响实验结果的判断。本文章通过DSS 使抗体和蛋白A/G磁珠紧密交联，即使高温或还原剂作用下也不会破坏交联的结构，而高温或还原剂可以使抗体和抗原分开，从而达到SDS检测到的条带都是蛋白条带而没有重链轻链条带的干扰的目的 关键词 DSS 重链 轻链 免疫沉淀 当抗原或抗原类似物侵入机体将诱导淋巴细胞尤其是浆细胞，分泌免疫球蛋白即抗体。本实验用的是实验室自制的多克隆抗体以及纯化蛋白，并且把蛋白用针剂注射至兔子身体内部，兔子在出现免疫之后会产生抗体。抗体的结构决定了抗体能够与抗原的特异性相结合。通过观察可以看出，抗体的结构图形与“Y”字母相似，分子量大小为150KDa，重链和轻链结构是由抗体在高温或还原剂作用下分解而来，在两条比较长的相对分子量中较大的是重链即H链，其分子量的具体大小是55KDa，而两条相对较短的中较小是轻链即L链，其分子量的具体大小是25KDa，“Y”两个分支的顶端含抗原的特异性结合位点，由重链和轻链共同决定。抗体具有较强而稳定的氨基酸结构，能够特异结合到抗原上，被应用到免疫沉淀，免疫荧光，免疫组化等免疫学实验技术中 进行蛋白质与蛋白质亦或是蛋白质同遗传物质之间互补作用的方法之一就是免疫沉淀。抗体具有能够同抗原进行特异性结合的特点，灵敏度高等优点，达到确定蛋白质机在体内的完整生理特性的效果。抗体通过捕获抗原达到富集，纯化，目的蛋白或和目的蛋白相互作用的蛋白的目的。但传统的实验中如果目的蛋白与抗体的重链轻链的大小一致或接近时，将会影响实验者对结果的判断。因为传统的实验中，抗原-抗体-蛋白A/G磁珠复合物在高温或还原剂作用下分裂为抗原-抗体复合物和蛋白A/G磁珠，所以在后续的SDS检测中的上样液含有抗体，结果中会出现抗体的重链和轻链有可能遮蔽目的蛋白条带，影响实验者对结果的判断。本实验中使用DSS交联剂使抗体和蛋白A/G磁珠紧密交联，在高温或还原剂作用下抗原-抗体-蛋白A/G磁珠复合物分裂为抗原和抗体-蛋白A/G磁珠复合物，在后续的SDS检测中的上样液将不含有抗体，凝胶结果中避免了抗体的重链和轻链的干扰，有利于实验者对实验结果进行精确分析 1 实验材料 1.1 主要仪器和试剂 DSS（Thermo scientific），抗体（实验室自制），蛋白A/G磁珠（Roche），NP-40蛋白裂解液（Biosharp），苯甲基磺酰（PMSF）， SDS凝胶试剂盒（博士德生物），4度超高速离心机（Thermo scientific），垂直混合仪（其林贝尔仪器公司），bio-rad蛋白电泳仪 1.2 动物材料 成熟昆明白小鼠（雄性） 2 实验方法 2.1 提总蛋白 实验之前充分准备好各种实验用品，包括手术器械、5ml玻璃军均浆器、1.5mlEP管、1ml枪头、200ul枪头、10ul枪头实行高压灭菌，同时放在烘箱里面备用。4度离心机预冷，匀浆器放入冰盒中冰镇，配蛋白裂解液（用120mM氯化钠溶液配0.5%NP-40），1ml蛋白裂解液中加10ul，0.1mM的苯甲基磺酰，混匀，放入冰盒中。断髓法处死小鼠，取小鼠睾丸组织100mg，称量时用吸水纸尽量吸干组织表面的水分，之后转存在冰镇的里面，同时放入具有的蛋白裂解液来进行均浆，所有的操作过程都在冰上进行，把均浆全部转移至管中1.5mlEP、4度、1000*g，离心10min。同时把清至转移到新型的EP管里面，放在冰块上面备用 2.2 蛋白A/G磁珠与抗体结合 准备实验试剂，配置溶液Ⅰ （0.01M中性磷酸盐溶液）。对蛋白A/G进行震荡，使得磁珠能够完全混到液体内部，便于液体的吸取，并且吸取混匀的50ul液体至1.5mlEP里。1000*g、4度、离心1min，去除上清。使用200ul溶液进行磁珠的清洗，1000*g、4度、离心1min，之后进行磁珠两次的重复清洗振荡蛋白A/G磁珠瓶子，使磁珠充分混匀到。去除上清，往EP管内加入90ul溶液Ⅰ 和10ul一抗溶液。将EP管固定在垂直混合仪上，以合适的转速使溶液混匀，在室温状态下孵育一个小时。在孵育之后，1000*g、4度、离心1min。弃去上清，EP管内加入200ul溶液Ⅰ清洗磁珠，此时抗体已和磁珠结合，1000*g、4度、离心1min。再次对磁珠进行两次的清洗 2.3 DSS交联蛋白A/G磁珠和抗体 准备实验试剂，配置2.5mM的DSS溶液，溶液Ⅱ0.1M，ph2.0。除去上述EP管内的上清，加