实验四基因工程制备重组细胞因子-人干扰素的制备与鉴定.ppt

实验九 重组细胞因子的制备与鉴定 -干扰素a-2b的制备与鉴定 第一次试验：转化和涂平板 1．感受态细胞制备: 2．转化和涂平板: 转化时连接产物加入感受态中后要冰浴30min，然后要非常快速的在42℃加热90sec，所以要提前将加热器温度设置到指定温度，再冰浴2min，之后需要置于37℃温床中振荡培养60h，之后离心再加IPTG，涂平板，正面向上培养需要30min，再倒置培养过夜。 3. 挑斑： 挑取三个单菌落，放入三支含LB培养基的试管中，置于37℃温床中振荡培养12h,然后同学们可以在晚上五点左右到实验室，将菌液取出30μl到新的LB培养基中，加入3μl IPTG，培养4h,取出，备用。 第二次实验：蛋白质沉淀 硫酸铵沉淀： 称一定质量的硫酸钠固体，加入菌液中，边加边振荡溶解，然后在加入硫酸铵固体，知道固体硫酸铵不再溶解。 透析：将混合液全部倒入透析袋中，封闭袋口，置于去离子水中，透析过夜，期间换水三次。 离心：将透析好的菌液倒入离心管中，置于低温高速离心机中，5000rpm、10min离心，弃上清，用100μl水溶解沉淀，备用。 乙醇沉淀： 加入两倍体积的95%乙醇，充分混匀。 离心：将混合液全部倒入离心管制，置于低温高速离心机中，5000rpm、10min离心，弃上清。 将离心管用保鲜膜封住上口，扎三个洞，置于冷冻干燥机中冷冻干燥过夜。 PH沉淀： 用1mmol/L的NaOH和1mmol/L的HCl调节菌液的PH，至PH的范围在5.7-6.7之间。 离心：将混合液全部倒入离心管制，置于低温高速离心机中，5000rpm、10min离心，弃上清。 将离心管用保鲜膜封住上口，扎三个洞，置于冷冻干燥机中冷冻干燥过夜。 第三次实验：活性鉴定，用ELISA法鉴定 2. 实验步骤： (1) 将ELISA试剂盒拿出来，于室温下平衡30min； (2) 建立标准曲线，设标准孔8孔，每孔中各加入样品稀释液100μl，第一孔加标准品100μl，混匀后用加样器吸出100μl，移至第二孔...如此反复作对倍稀释至第六孔，最后，从第六孔中吸出100μl弃去,第七孔为空白对照，第八孔为零孔； (3) 加样：分别设空白孔，待测样品孔，除空白孔以外，余孔加待测样品100μl,注意不要有气泡，轻轻混匀，酶标板加上盖，37℃反应30min后弃去孔内样品； (4) 洗涤：加满稀释后的洗涤液，轻轻混匀，60S后倒去，在滤纸上印干，重复5次； (5) 加酶：空白对照孔不加酶，其余孔加入酶标记物50μl，放入37℃温箱中反应30min后，弃去溶液； (6) 洗涤：按照上次的洗涤方式洗涤5次；每孔加入底物液A、B各50μl，置37 ℃避光反应15分钟，注意加底物液B时要避光； (7) 终止：每孔加入终止液50μl，终止反应，此时溶液颜色由绿色转化为黄色；测OD值：在波长为450nm处测OD值。