实验硫酸铵分级沉淀分离苯丙氨酸解氨酶.ppt

实验（一）硫酸铵分级沉淀分离苯丙 氨酸解氨酶（8学时） 一、实验背景 了解硫酸铵沉淀蛋白质的原理；掌握分级沉淀分离酶的基本操作和方法 二、实验原理 盐析： 在蛋白质溶液中加入一定量的中性盐（如硫酸铵、硫酸钠等）使蛋白质沉淀析出称为盐析，因为中性盐在水中解离时，能夺走蛋白质胶粒表面的水分子，破坏水膜结构；同时中性盐解离后形成的带电离子能中和蛋白质表面的电荷，这两种作用使溶液中蛋白质沉淀析出。 分级沉淀： 不同盐浓度下各种蛋白质的溶解度是不同的，因此调节溶液的盐浓度可使各种蛋白质先后沉淀出来，或者使需要的酶与其它杂质蛋白分开，达到提纯目的，这就是分级沉淀法。 硫酸铵沉淀一般在蛋白纯化的步骤中前期用，它简便且重复性好，但纯化倍数不高。分级沉淀中需加的固体硫酸铵或饱和硫酸铵溶液的量，可从硫酸铵饱和度量表中查得。 苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine:ammonia lyase，简称PAL）是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶，与一些重要的次生物质如木质素、异黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切有关，在植物的正常生长发育和抵御病菌侵害的过程中起重要作用。 PAL催化L-苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸和氨，产物反式肉桂酸在波长290nm处有最大吸收值。在反应系统中如果酶的加入量适当，反式肉桂酸的生成速率即A290升高的速率可在几小时内保持不变，因此，可通过测定A290 升高的速率来测定PAL的活力。规定1小时内A290增加0.01为PAL的一个活力单位。 三、实验试剂 0.1mol/L硼酸-硼砂缓冲液（PH8.7） 酶提取液—0.1mol/L硼酸-硼砂缓冲液（内含1mmol/L EDTA、20mmol/Lβ-巯基乙醇）。取100ml 0.1mol/L 硼酸-硼砂缓冲液（PH8.7）,加入0.037克EDTA钠盐，混匀，临用前再加入0.137mlβ-巯基乙醇，混匀； 0.6mmol/L L-Phe溶液。 称取L-Phe 9.912毫克溶于100ml蒸馏水中； 6N HCl溶液 固体（NH4）2SO4 四、实验步骤 1、 酶液提取： （1）取小麦幼苗（发芽5~6天）2克，用剪刀剪成小段后，立即放入有10 ml酶提取液的研钵中，于冰浴上研磨匀浆，匀浆结束前，再加入10ml酶提取液研磨混匀 （2）将已匀浆的酶液，用三层纱布过滤、挤干。滤液转入离心管，平衡后，于10,000 g下冷冻离心30min； （3）取离心后的上清液（酶粗提液），量出其体积V1，放置冰浴中备用。 实验步骤 2. 硫酸铵分级沉淀酶蛋白： （1）从酶粗提液中吸取出0.5 ml，以作后面活力测定等用，根据实际体积和硫酸铵饱和度用量表，算出达到40%饱和度实际应加入酶液中的硫酸铵量，并称取该量的硫酸铵； （2）将酶液到入烧杯内，烧杯置于冰浴中，然后在边缓慢搅拌下缓慢加入称好的固体硫酸铵（不能有大颗粒，放在研钵中研碎），待全部硫酸铵加入后，再缓慢搅拌20min； 实验步骤 2. 硫酸铵分级沉淀酶蛋白： （3）将上述溶液到入离心管，3,000g下冷冻离心30min，倒上清液于烧杯内，保留沉淀，记为沉淀1； （4）根据硫酸铵饱和度用量表中，查出从40%到75%饱和度所需硫酸铵用量，算出并称取实际应加的硫酸铵量； （5）按上述（2）、（3）步同法处理，离心后，倒出上清液，保留沉淀，记为沉淀2。 实验步骤 3.酶活力测定： （1）将沉淀[1]和沉淀[2]分别溶于1ml酶抽提液中，待沉淀全部溶解后，量出其体积V2、V3，记为沉淀液[1]和[2]； （2）分别从沉淀液[1]和[2]中吸出0.2ml加入另外二个试管内，然后用酶提取液分别将其稀释成1ml，记为稀释沉淀液[1]和[2]； （3）取试管7支，按下列编号并加入各试剂： 管 试 号 剂 0 1 1 2 2 3 3’ PH8.7 0.1mol/L 硼酸缓冲液（ml） 4.0 3.9 4.9 3.9 4.9 3.9 4.9 酶粗提取液(ml) / 0.1 0.1 / / / / 稀释沉淀液[1](ml) / / / 0.1 0.1 / / 稀释沉淀液[2]（ml） / / / / / 0.1 0.1 0.6mmol/L L-Phe(ml) 1.0 1.0 / 1.0 / 1.0 / 实验步骤 3.酶活力测定： （4）以上试管放入恒温水浴（40℃）中保温60 min后，立即加入0.2ml 6N HCl，混匀，终止反应； （5）于波长290 nm处，以0号管溶液调零，分别记录测得的各管A290值。 酶活单位定义：规定1小时内A290增加0.01为PAL的一个活力单位。 1、P