DNA提取及常见问题解决方案.ppt

DNA提取原则 一、标本的要求和保存 血液 EDTA做抗凝剂，不可用肝素 RNA 尽快提取或者-20℃保存 DNA 4℃短期保存 组织 新鲜组织 液氮罐保存（-80℃） 石蜡玻片和包埋组织 应没有H.E染色 室温保存 核酸提取的一般过程 I.材料准备 II.破碎细胞或包膜－内容物释放 III.核酸分离、纯化 IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质 V.核酸溶解在适量缓冲液或水中 1）破碎细胞（防止核酸酶的作用） ①机械方法：研磨法、匀浆法； ②物理法；反复冻融，总热骤冷法、超声波法 ③化学及生物法，自溶法 用SDS处理细胞、渗透法 蛋白酶K法 、溶菌酶 2）DNA的纯化 根据核酸的性质和特点除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。 硅质材料 高盐低PH值结合膜，低盐高PH值洗脱。快速高效。 沉淀法 2倍体积的无水乙醇或者0.6倍体积的异丙醇。 阴离子交换树脂 低盐高PH值结合核酸，高盐低PH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。 磁珠 磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。 DNA的保存 核酸保存的主要条件是温度和介质 温度： 4℃保存 最佳和最简单（短期保存） -20℃保存 （长期保存） 保存介质： TE缓冲溶液(最常用) 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0 一、基因组DNA-CTAB法 （1）CTAB法原理（植物DNA提取经典方法） CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐溶液（ Nacl ＞0.7mol/L ）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 二、基因组DNA-SDS法 （1）原理 SDS是一种阴离子蛋白质变性剂，在高温(55 -65℃）条件下能裂解细胞．细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸。 提高盐(KAc或NH4Ac）浓度并降低温度(冰浴)，使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀。 上清液用酚/氯仿反复抽提除去蛋白质，再用乙醇沉淀水相中的DNA。 然后用RNase酶除去RNA即可得到较纯的DNA. 三、实验室提取DNA的经典方法 酚-氯仿法提取DNA 蛋白酶K破损细胞 酚、氯仿作为蛋白质的变性剂 无水乙醇纯化DNA DNA 酚－ 氯仿法提取的模板质量最好，保存时间也长，但操作步骤繁杂，成本也高，而且酚和氯仿均有挥发毒性，对环境造成诸多危害，长期使用严重危害人体健康。 浓度纯度的测定 紫外分光仪 OD280 蛋白质的最大紫外吸光度 OD260 DNA的最大紫外吸光度 DNA纯度范围 1.7 OD260/OD2801.9 DNA提取中常见问题及解决方案 问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。 问题二：DNA降解 问题三：DNA提取量少 * * 1、应保证核酸一级结构的完整性； 2、排除其它分子的污染 3、其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。 破碎细胞 提取 纯化 结果分析 原因 DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质 DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应 DNA中残留有金属离子 对 策 重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质 重新沉淀DNA，让酒精充分挥发 增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次） 原因 材料不新鲜或反复冻融 未很好抑制内源核酸酶的活性 提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断 外源核酸酶污染 反复冻融 对 策 尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融 液氮