怎样用好液相色谱.ppt

液 相 色 谱 分 析 影响分辨率的因素：k’，α，N 分辨率的方程： k’是容量因子，表达了样品与填料的作用强弱。 α是选择性系数，描述两化合物分离的好坏程度， 是化学因素。 N是理论塔板数，描述色谱峰的谱带展宽程度。 液 相 色 谱 分 析 色谱柱的柱效N 理论塔板数计算公式： 液 相 色 谱 分 析 提高柱效的方法 色谱柱本身 减小填料的颗粒度 找到最佳的流速（根据不同的内径） 合适的温度 降低溶剂的粘度 增加柱长 液 相 色 谱 分 析 其他影响柱效的因素 柱外效应 连接管路 进样器 检测器 进样体积 样品浓度 液 相 色 谱 分 析 容量因子K’ 与峰高的关系 与R的关系 改变K’值的方法： 调节流动相的极性、pH、离子强度等 梯度淋洗 k’=(tR-t0)/ t0 液 相 色 谱 分 析 选择性系数α 定义： α＝1时两组分分不开， 改变α的途径： 改变流动相 改变固定相 改变温度 改变样品的本身性质 液 相 色 谱 分 析 α、K’、N 如何控制分辨率 原始分离状态 改变 K’ 后 改变 α 后 改变 N 后 液 相 色 谱 分 析 分析方法建立的实例 等度分析 色谱柱：C18，4mm×30mm 流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱 流速：2ml/min 样品： ① 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) ② 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) ③ 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben) 液 相 色 谱 分 析 分析方法建立的实例 改变容量因子 K 液 相 色 谱 分 析 分析方法建立的实例 改变选择性∶a 通过改变流动相改变选择性 同样强度的不同溶剂 改变色谱柱 1 2 3 THF/H2O 28:72 MeOH/H2O 58:42 CH3CN/H2O 38:62 液 相 色 谱 分 析 分析方法建立的实例 梯度方法的建立 梯度洗脱的特点 优点 单位时间的分离能力增加 检测灵敏度提高 缺点 仪器设备要求高 不适合某些检测方式 柱需再生 定量分析的重复性较低 分析时间长 液 相 色 谱 分 析 分析方法建立的实例 梯度的洗脱方式 高压梯度及低压梯度 溶剂 A 溶剂 B 泵 A 泵 B 混合器 A 高压梯度 溶剂 A 泵 溶剂 B 比例阀（溶剂混合点） 混合器 B 低压梯度 （溶剂混合点） 液 相 色 谱 分 析 分析方法建立的实例 梯度洗脱的可变参数 A及B(可能还有C和D液)的 成分和化学特性 梯度的陡度 梯度的变化形状 液 相 色 谱 分 析 分析方法建立的实例 如不用梯度：分离不理想 液 相 色 谱 分 析 分析方法建立的实例 梯度条件的优化 液 相 色 谱 分 析 分析方法建立的实例 梯度曲线的变化∶凹线 液 相 色 谱 分 析 分析方法建立的实例 梯度曲线的变化∶凸线 液 相 色 谱 分 析 分析方法建立的实例 梯度平衡时间的影响（一） 10分钟的梯度，6分钟的平衡时间色谱图不重复 液 相 色 谱 分 析 分析方法建立的实例 梯度平衡时间的影响（二） 平衡时间∶6分钟 平衡时间∶7分钟 平衡时间∶8分钟 平衡时间∶9分钟 平衡时间从6到7分钟，第一个峰的保留时间有明显的变化，说明6到7分钟的平衡时间不足，而8到9分钟变化不大因而大于这个时间时，平衡充足。 液 相 色 谱 分 析 分析方法建立的实例 有机污染物的影响（一） 50ml超纯水的有机物污染状态 液 相 色 谱 分 析 分析方法建立的实例 有机污染物的影响（二） “三蒸水”有大量的有机污染物不适合梯度分析 液 相 色 谱 分 析 分析方法建立的实例 有机污染物的影响（三） 典型的“实验室水”有大量的有机污染物不适合高灵敏度梯度分析 注意事项： 溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差，进行样品之前必须进行空白梯度洗脱 ，以辨认溶剂杂质峰。 梯度混合的溶剂互溶性要好 梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器） 每次梯度洗脱之后要对色谱柱进行充分的平衡。 梯度洗脱 溶剂混合产生的问题 流动相中所使用的不同溶剂必须互溶 流动相中溶剂不互溶会导致: 1. 基线漂移， 2. 保留时间的重现性差， 3. 出现肩峰和“鬼峰”的问题. 流路中形成气泡引起的问题 改变保留时间和峰面积 流动相中形成气泡对液流的不良影响 泵中形成气泡使液流波动 峰变形 柱中气泡形成和累积使流动相绕流 尖峰或锯齿状噪声 检测池中气泡形成和累积产生基线噪声 液 相 色 谱 分 析 实