微生物学实验10.ppt

实验10 滤膜法测定水中总大肠菌群 一、实验目的 了解大肠菌群的检测方法。 背景知识 大肠菌群的定义:大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：在37℃ 24 h能分解乳糖产酸、产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 一般认为该菌群细菌可包括埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属等。 大肠菌群=大肠杆菌吗？ 大肠菌群包括大肠杆菌。大肠菌群指能够发酵乳糖产酸产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)习惯称为大肠杆菌，分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。 大肠菌群的卫生意义 大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。 为什么？ 粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），呈正相关性。因而利用大肠菌群数反映水体或食品中的粪便污染状况，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。 为何不直接测定致病菌数量？p204 大肠菌群的检验比较简单，但其和粪便污染的相关性还受到质疑，原因是其中的一些细菌能够在环境样品中检出。 ?? 相对来说，粪大肠菌群对粪便污染的指示作用更为直接和贴切，而且检测方法相对大肠杆菌简单，为此是一种较好的粪便指示菌（或称为“指示菌群”）。与大肠菌群相比，粪大肠菌群在人和动物粪便中所占的比例较大，而且在自然界容易死亡。因此，粪大肠菌群的存在表明食品可能直接或间接的受到了近期的粪便污染 。粪大肠菌群又叫耐热大肠菌群，主要就是大肠杆菌，但也包括克雷伯氏菌属。 2 原理（滤膜法） 滤膜是一种微孔薄膜，选择孔径为0.45~0.65 μm的滤膜，能滤过大量水样，并将水中含有的细菌截留至滤膜上，然后将滤膜贴在选择性培养基上，经培养后，直接计数滤膜上生长的典型大肠菌群菌落，算出每升水样中含有的总大肠菌群数 伊红美蓝琼脂含有伊红和美蓝两种苯胺类染料，它们可以抑制革兰氏阳性菌的生长。同时，这些染料可以区分那些发酵乳糖的微生物。大肠菌群因其强烈发酵乳糖而产生大量的混合酸，使菌体表面带上正电荷，可染上伊红染料，伊红与美蓝结合，菌体被着上深紫色，在含有两种染料的培养基上，形成带核心、具金属光泽的菌落。 3实验材料 滤器 6套 滤膜，孔径0.45~0.65μm。直径根据滤器规格，目前常用的有2.5cm和4.7cm两种 抽滤设备7台 尖头镊子6把 恒温箱 95%酒精及酒精棉，用于灼烧灭菌过滤器 采样瓶、移液枪及枪头 伊红美兰琼脂平板 4 实验步骤 4.1 准备工作 4.1.1 水样采集 4.1.2滤膜灭菌：将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，煮沸灭菌三次，每次15min。前两次煮沸后需更换水洗涤2~3次，以除残留溶剂。 4.1.3配制伊红美蓝平板 （已配） 4.1.4 滤器灭菌：用点燃的酒精棉球，火焰灭菌。也可用121℃灭菌20min 5.2 过滤水样 5.2.1 用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，帖放已灭菌的滤床上，稳妥地固定好滤器，将10 mL （1 mL、0.1 mL）水样注入滤器中，加盖，打开滤器阀门，在负压0.5大气压下抽滤。（每个梯度两个平行） 5.2.2 水样过滤完后，暂不关过滤泵，取下滤器，于负压下用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在伊红美兰培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得有气泡，关闭过滤泵，然后将平皿倒置，放在37℃恒温箱内培养22~24h。 5.3 观察结果 5.3.1 挑选符合下列特征菌落进行记数。 深紫黑色，具有金属光泽的菌落； 紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落； 淡紫红色，中心色较深的菌落。 5.4 验证 革兰氏染色、芽孢染色、乳糖蛋白胨半固体培养基培养。 大肠菌群指能够发酵乳糖产酸产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 5.5 大肠菌群数的计算 1L水样中大肠菌群数等于滤膜上生长的大肠菌群落总数乘以n。 注意事项 火焰灭菌时避免烫伤。 玻璃砂芯过滤器，易碎且价格昂贵，同学使用过程中应细心、注意安全。 取滤膜时，统一夹取边缘部分，以免损坏滤膜，影响过滤效果。 滤膜和培养基之间不应有气泡。 培养温度和时间应控制好。37℃，22-24h（隔天观察，严格注意安全，清理并灭菌）。 思考题 用滤膜法测细菌总数，该如何处理？（滤膜孔径、培养基、过滤量） 滤膜法相对于多管发酵法的优缺点是什么？p206 工作安排 6个同学