总RNA提取及免疫组化.ppt

细胞总RNA的提取 RNA纯度的判断 280、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、盐浓度和蛋白等有机物的值 A260/A280 1.8—2.0 ＜1.8表明有蛋白质、苯酚的污染 ＞2.2表明RNA已经水解成单核酸 A260/A230 2.0 ＜2.0表明酚盐离子，硫氰酸盐或其他有机化合物污染 免疫组化的原理及流程介绍 免疫组化原理及流程介绍 主要内容 免疫组化原理及流程介绍 三 免疫组化的基本流程 免疫组化原理及流程介绍 1)用封闭通透液浸润切片 30 min（RT 避光）。 其配法是用预热 40 ml PBS 加120ul TritonX-100 加热几分钟，在临用前加 400 ul的30％H2O2。 2)PBS 溶液洗 3 次×3 min。 免疫组化原理及流程介绍 将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周围画上圈,在圆圈内组织滴入 5%羊血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中,室温 (约30℃)下10～30min。 免疫组化原理及流程介绍 一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。 一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，然后4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要摸索。 免疫组化原理及流程介绍 甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗（1：250、500、1000）后，放入湿盒中室温 1 小时，然后 4 度过夜，冰箱中取出后需37 ℃复温 45 min。 免疫组化原理及流程介绍 二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索。 但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。 免疫组化原理及流程介绍 1)将一抗倒掉并用 PBS 洗 5 min×5 次； 2)用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放入 37℃恒温烤箱中 30 min。 3)用 PBS 洗 5 次×5 min 免疫组化原理及流程介绍 免疫组化原理及流程介绍 1) 用 PBS 3 次×3min 后，用双蒸水洗 5 min；加一大滴苏木素染液，（胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜蛋白染 20 s ），自来水冲洗，双蒸水洗 5 min，再用 PBS 返蓝 5 min。 2) 脱水：50% ethanol (1-2) min;70% ethanol (1-2) min ;95% ethanol （1-2） min； 95% ethanol （1-2） min； 100% absolute ethanol: (1-2) min； 100% absolute ethanol: (1-2) min。 3) 透明：Xylene 1×(1-2) min→Xylene 2×(1-2) min 4) 封片：中性树胶。 免疫组化原理及流程介绍 免疫组化原理及流程介绍 1.苏木素复染时间需要摸索，尤其要考虑阳性染色的位置。 2.切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆盖组织充分；每次加 液前甩干洗涤液，但又防止干片 。 免疫组化原理及流程介绍 3.以下原因可能导致片子着色不均匀： ① 脱蜡不充分。可以 60 ℃烤 20 min，立即放入新鲜的 二甲苯中； ② 水化不全。应经常配制新鲜的梯度乙醇； ③ 抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗/二抗等试剂； ④ 抗体孵育时，切片放倾斜； ⑤ 抗体孵育后 PBS 冲洗不充分。 ⑥ 制片厚薄不均匀等问题。染片盒不平，切片倾斜。 免疫组化原理及流程介绍 5.PBS的PH和离子强度的使用。 免疫组化原理及流程介绍 4.一抗的清洗： 免疫组化原理及流程介绍 5.一抗孵育 一抗:可以特异结合底物，就是识别出我们想要检测的东西。一抗和底物结合与否用肉眼是看不出来的。 1.防止脱片；2.使抗原抗体结合更稳定。 具体做法： 免疫组化原理及流程介绍 6.二抗孵育 二抗:可以和一抗结合，并带有可以被检测出的标记(如带荧光、放射性、化学发光或显色基团），作用是检测一抗。 具体操作： 7.SP反应 SP染色法即链霉素抗生物素蛋白 生物素过氧化酶连接法。 该法是ABC法基础上的进一步改良，使卵白素与链霉（而非生物素）结合，而后再结合PO基。 1） 加入 SP 复合液后放入 37 度烤箱中 30 min。 2） 用 PBS 洗 5 次×5 min。 具体操作： SP染色法的特点: 灵敏特异性低，成本低。 免疫组化原理及流程介绍 8.显色 在免疫组化中，由于抗原抗体所形成的复合物本身