FLIPR 钙6 检测试剂盒(Molecular Devices).pdf

FLIPRTETRA 高通量实时荧光成像分析系统应用系列 （8 ） 钙流高效筛选的不二之选 ——FLIPR 钙6 检测试剂盒 Molecular Devices 公司生产的FLIPR® 钙离子检测试 然而，独特的FLIPR 钙 6 检测试剂盒的染料是对有 阴离子转运体耐受的，因而只需加入很少不不加入丙 优势： 剂盒采用了钙离子敏感的指示剂以及专利的屏蔽染料 磺舒。 以确保研究者进行高灵敏的用于G 蛋白偶联受体、离 子通道和其它钙离子敏感的靶标的荧光筛选。采用新 FLIPR 钙6 and 钙6-QF 实验准备 型的染料构成进一步的提升了钙流结果的检测窗口和 实验稳健性，同时实验方案更灵活。如图1所示，FLIPR 在本实验中我们使用的是FLIPR 钙6 (P/N:R8190) 钙6 试剂含有的屏蔽成分不进入细胞内部，但显著性 和钙6-QF (P/N:R8192) 小包装试剂盒。两者的染料 均溶于含20MMHEPES 的Hank’s平衡盐溶液 的降低胞外钙离子指示染料残留、培养基和其它成分 引起的背景荧光。FLIPR 钙 6-QF 检测试剂盒成分 （HBSS ）中。丙磺舒（Probenecid，PBX) 一并加 入以防止染料被转移至细胞外。贴壁的CHO M1 细 （也如图1 所示）不含有屏蔽组分，对淬灭剂敏感 靶标或多通道应用试验提供了一种新的、灵活的选 胞实验前一天的晚上被种在384 孔黑色低头的细胞 择。另外的应用便利之处在于试验中要求很小的或不 板上，实验前从培养箱中取出分别加入25µL FLIPR 加入丙磺舒也可以。许多细胞（例如 CHO ）具有阴 钙6、钙6-QF 或钙5 检测试剂盒的染料，或者竞争 离子交换蛋白，需要加入阴离子再摄取抑制剂，例如 者的染料，每孔中自身含有25µL 实验缓冲液或培 养基。 丙磺舒，以保持细胞内钙离子指示染料不被转出。 图1. 含或不含屏蔽成分的FLIPR 钙6 分析实验的灵活特性 Calcium 6 Calcium 6-QF 一步操作，显著降低背景荧光 不含有屏蔽组分，适用于对淬灭 剂敏感靶标或多通道应用试验 在FLIPR 或FlexStation®微孔读板机中使用钙离子敏感染料指示剂检测胞浆内 Ca2+浓度的增加 加载了FLIPR钙6和钙6-QF试剂染料后，在37°C、5% CO2 图2. FLIPR钙6 试剂盒带来最大的检测窗口 条件下孵育2小时。FLIPR钙5试剂染料和竞争者的染料按照 建议的方案实验前在37°C、5% CO2条件下孵育1小时。在 FLIPR® Tetra 系统或 FlexStation® 3 微孔读板机中信号 检测前从培养箱中取出所有细胞板并在室温下冷却10分钟。 加载了FLIPR钙流检测染料或Fluo-4 Direct 染料的细胞板 中无需再用缓冲液冲洗。而加载了Fluo-4染料的细胞板需要 再用HBSS缓冲液冲洗三次。 FLIPRTetra 和FlexStation 3 系统中的钙流检测试验 在384孔聚丙烯化合物板用含20 mM HEPES 的HBSS缓冲 液溶解配制5倍终浓度的相应的配体化合物。激动剂在实验 过程中通过FLIPRTetra和FlexStation 3系统加入。大约在90