04002226_1_1 - 东南大学生物电子学国家重点实验室.DOCVIP

浅谈基因芯片 邹焕中 随着人类基因组计划(?human?genome?project)即全部核苷酸测序的即将完成，人类基因组研究的重心逐渐进入后基因组时代（?postgenome?era）向基因的功能及基因的多样性倾斜。通过对个体在不同生长发育阶段或不同生理状态下大量基因表达的平行分析，研究相应基因在生物体内的功能，阐明不同层次多基因协同作用的机理，进而在人类重大疾病如癌症、心血管疾病的发病机理、诊断治疗、药物开发等方面的研究发挥巨大的作用。它将大大推动人类结构基因组及功能基因组的各项基因组研究计划。基因芯片（Gene Chip)准确的讲（或者说是狭义的基因芯片）是指DNA芯片（DNA　Chip)，其原理是指利用现代探针固相原位合成技术、照相平板印刷技术、高分子合成技术等微电子技术把大量分子生物学技术（包括南北印迹技术、探针杂交技术、PCR等）具体而微的固定在一定狭小的空间内，以实现高速度、高通量、集约化和低成本的分析技术。基因芯片的概念现已泛化到生物芯片（biochip）、微阵列（Microarray）、DNA芯片（DNA chip），甚至蛋白芯片。基因芯片的创意来自于计算机芯片。它和计算机芯片一样，具有超微化、高度集成、信息贮存量大等特点，所不同的是，计算机芯片采用的是半导体集成电路，而基因芯片是以基因片段作为“探针”进行工作。所谓“探针”，是利用碱基配对的原理检测基因的一种技术。它就好比是用鱼杆钓鱼。以前的基因检测技术均只有一个“鱼钩”，一次只能钓到一条鱼（即找到一种基因）。而基因芯片突出的优点是能在庞大的基因库中，一次发现众多的异常基因，就好比在一根鱼杆上垂有成千上万个钓钩，可同时捕捉许多不同的鱼，从而实现快速多样化检测。 (一)元件型微阵列芯片1生物电子芯片2凝胶元件微阵列芯片3药物控释芯片；(二) 通道型微阵列芯片1毛细管电泳芯片2 PCR扩增芯片3集成DNA分析芯片4毛细管电层析芯片；(三)生物传感芯片1光学纤维阵列芯片2白光干涉谱传感芯片。 基因芯片主要技术流程包括：芯片的设计与制备；靶基因的标记；芯片杂交与杂交信号检测。基因芯片的设计实际上是指芯片上核酸探针序列的选择以及排布，设计方法取决于其应用目的，目前的应用范围主要包括基因表达和转录图谱分析及靶序列中单碱基多态位点（single?nucleotide?polymorphism，snp）或突变点的检测，表达型芯片的目的是在杂交实验中对多个不同状态样品(不同组织或不同发育阶段、不同药物刺激)中数千基因的表达差异进行定量检测，探针序列一般来自于已知基因的cdna?或est库，设计时序列的特异性应放在首要位置，以保证与待测目的基因的特异结合，对于同一目的基因可设计多个序列不相重复的探针，使最终的数据更为可靠。基因单碱基多态检测的芯片一般采用等长移位设计法［5］，即按靶序列从头到尾依次取一定长度的互补的核苷酸序列形成一探针组合，这组探针是与靶序列完全匹配的野生型探针，然后对于每一野生型探针，将其中间位置的某一碱基分别用其它三种碱基替换，形成三种不同的单碱基变化的核苷酸探针，这种设计可以对某一段核酸序列所有可能的snps位点进行扫描。基因芯片制备DNA，有时也用于寡核苷酸，甚至mRNA。原位合成有两种途径。一是光蚀刻法；一是喷印法。与原位合成法比较点样法较简单，只需将预先制备好的寡核苷酸或cDNA等样品通过自动点样装置点于经特殊处理的玻璃片或其它材料上即可。 1　原位光蚀刻合成 寡聚核苷酸原位光蚀刻合成技术是由Affymetrix公司开发的，采用的技术原理是在合成碱基单体的5羟基末端连上一个光敏保护基。合成的第一步是利用光照射使羟基端脱保护，然后一个5端保护的核苷酸单体连接上去，这个过程反复进行直至合成完毕。使用多种掩盖物能以更少的合成步骤生产出高密度的阵列，在合成循环中探针数目呈指数增长。某一含n个核苷酸的寡聚核苷酸，通过4×n个化学步骤能合成出4n个可能结构。目前，用于分子诊断的DNA芯片不仅已可用于检测爱滋病病毒基因还可用于囊性纤维化（CF）、乳腺癌、卵巢癌等疾病相关基因的基因诊断。鉴于光刻设备技术复杂，只能有专业化公司生产，加之成本高及合成效率不高的问题，因此有待进行以下研究：⑴对光刻技术进行改进，提高合成效率；⑵开发新的原位合成技术，如喷印合成技术，该技术既能进行原位合成又能进行非原位合成。另一方法是光导原位合成法。具体方法是在经过处理的载玻片表面铺上一层连接分子（linker），其羟基上加有光敏保护基团，可用光照除去，用特制的光刻掩膜（photolithographic mask）保护不需要合成的部位，而暴露合成部位，在光作用下去除羟基上的保护基团，游离羟基，利用化学反应加上第一