NET-1、PCNA、p27及其相关分子在HCC.PPTVIP

* * 研究肝癌中NET-1基因与p27及其磷酸化降解分子的相关性及对癌预后的影响 陈莉，王桂兰，秦婧，吴园园，朱建伟 南通大学医学院病理学教研室 南通大学附属肿瘤医院病理科 原发性肝细胞肝癌( HCC)是高度恶性的肿瘤，2000年全球有62.6万人发病，死亡59.8万人，其中约55％发生在中国，其死亡率高居我国肿瘤死亡率的第二位。南通启东地区是世界卫生组织确定的肝癌高发研究现场。 HCC的发生发展的精确分子机制尚不完全清楚。因此, 进一步探索研究新的基因功能改变与HCC发生、发展及其恶性特征的关系，设计合理的治疗药物及判断预后，在提高我国HCC的诊治水平中具有重要意义。 NET-1与NET-2到NET-7一起统称为NET-X，它们是由Serru等于2000年在EST 数据库中发现的7 个新的含4 次跨膜蛋白超家族( transmembrane 4 superfamily 或tetraspan family, 简称TM4SF) 的成员。 NET-1(C4.8、P503s、Tspan-1) 定位于染色体1p34.1上，其mRNA全长为1297bp(基因库登记号码AF065388)，为TM4SF的成员之一，最近证实其为肿瘤相关基因。 p27作为细胞周期重要负性调控因子，受多种因素调控。细胞外信号调节激酶(ERK) 是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)中一条主要和经典的并与人类癌症关系最为密切的途径，p27蛋白是ERK信号通路下游的重要分子。p27的基因突变非常罕见，对p27的功能调控主要发生于转录后阶段，通过蛋白磷酸化修饰来发挥其生物学效应。p27分子内存在数十个潜在的磷酸化位点，其中以N端第10位丝氨酸（S10）及C端第187位苏氨酸（T187）最为重要，占p27蛋白总磷酸化水平70%以上。p-p27T187可启动S期激酶相关蛋白2（Skp2）分子介导的p27多聚泛素化及随后降解 。有证据显示JAB1与p27的出核转运有关。它能够促进p27从胞核向胞浆的移位，加速p27泛素蛋白酶体途径的降解 。 1、构建重组表达质粒 NET-1siRNA、myc-NET-1和 pEGFP-myc-p27 (WT) 。 2、细胞培养与转染 3、Western blot检测蛋白表达 4、免疫共沉淀分析NET-1与p27的相互作用关系 5、免疫组化检测 6、临床病例与预后分析 一、 材料与方法 二、结果 1、NET-1对细胞周期相关蛋白p27、 p-p27T187、Skp2、ERK、p-ERK及PCNA表达的影响 GFP抗体检测结果显示除未处理组外，转染myc-p27和pEGFP-N组中均有显著的GFP表达，表明在转染后SMMC-7721细胞中表达外源性p27（line 1）。p27抗体检测结果显示各组细胞中均表达p27，但在转染myc-p27组中显著增加，表明转入外源性p27可以增强内源性p27的表达（line 2）。 免疫共沉淀的结果显示在SMMC-7721细胞中GFP-p27可以与myc- NET-1一起，共同被抗myc抗体免疫沉淀下来。提示p27与NET-1存在相互作用。5%的全细胞裂解液用于阳性对照。 2、 p27与NET-1在肝癌SMMC-7721细胞中存在相互作用 NET-1阳性率为97.3% Ki67阳性率为94.7% 3、HCC中NET-1蛋白表达与Ki67表达 NET-1、p-p27T187、p-p27S10、PCNA、及JAB1均在癌中高表达。 p27均在癌旁核内高表达。 4、HCC组织和癌旁组织中NET-1/p27的表达 NET-1、p-p27T187、p-p27S10、PCNA、及JAB1均在癌中高表达。 p27均在癌旁核内高表达。 HCC组织和癌旁组织中 NET-1/p27的表达 癌中 癌旁 NET-1在HCC、癌旁组织和血管瘤旁肝组织中表达呈递减趋势，不同组间的差异均有显著的统计学意义。JAB1、p-p27T187、p-p27S10和PCNA在HCC中表达显著高于癌旁组织和血管瘤旁肝组织，但后两组间差异无显著统计学意义；p27在癌旁组织和血管瘤旁肝组织中表达显著高于HCC中，但前两组间差异无显著统计学意义。 5、NET-1、PCNA、p27及其相关分子在HCC、癌旁组织和正常肝组织中表达 (1) NET-1与p27Kip1的表达呈负相关(r =－0.6078，P 0.001) (2) NET-1与JAB1的表达则成正相关（r =0.6866，P 0.001） (3) NET-1与PCNA的表达则成正相关（r =0.5645，P 0.001） 6、HCC中NET-1、PCNA、p27及其相关分子表达的相关性 （1） Log-r