序列分析 - 东南大学生物电子学国家重点实验室.DOCVIP

第四节 DNA片段组装 DNA分子的序列是通过核酸测序技术得到的。对于完整基因组自上而下的测序过程一般包括三个步骤：（1）建立克隆的物理图谱，如酵母人工染色体YAC（Yeast Artificial Chromosome）克隆、细菌人工染色体BAC（Bacterial Artificial Chromosome）克隆等；（2）利用鸟枪法（Shotgun Strategy）测定每个克隆的序列；（3）注释。当得到一段DNA序列之后，可以利用序列分析工具，通过与数据库序列的比较，得到与该序列相关的信息，如基因、调控元件、重复区域等，进而对序列的生物学特性进行注释。人类基因组计划（HGP）采用的就是这种策略。Venter提出的战略构想（Venter ET AL.,1998）正好与目前的人类基因组计划相反，即首先是测序，然后才是在测序的基础上作图。Venter把这种战略称为“全基因组随机测序”也称为“全基因组鸟枪战略”(whole genome shotgun strategy)。 在大规模DNA测序中，目标DNA分子的长度可达上百万个bp。现在还不能直接测定整个分子的序列，然而可以得到待测序列的一系列序列片段，这些序列片段覆盖待测序列，并且序列片段之间也存在着相互覆盖或者重叠。序列片段是DNA双螺旋中的一条链的子序列（或子串）。在一般情况下，对于一个特定的片段，我们不知道它是属于正向链还是属于反向链，也不知道该片段相对于起点的位置。另外，这样的序列片段中还可能隐含错误的信息。序列片段的长度范围300—1000 bp，而目标序列的长度范围是30000—1000000 bp，总的片段数目可达上千个。DNA序列片段组装（sequence assembly，又称序列拼接）的任务就是根据这些序列片段，重建目标DNA序列。如果能够得到DNA一条链的序列，那么根据互补原则，另一条链的序列也就得到了。本章讨论DNA片段组装的基本问题，详见有关参考文献（Setubal and Meidanis, 1997）。 1、片段组装问题 序列片段组装的定义如下：给定一组取自特定字母表的字符串集合S，寻找一个最短的字符串s，使得S中的每一个字符串都是s的一个连续子串。这里，集合S的字符串相当于待组装的序列片段，而s则是序列片段组装的结果。 假设有下列4个DNA序列片段ACCGT、CGTGC、TTAC和TACCGT，并且已知目标序列的长度约为10，如图3.21（a）所示。可以按图3.21（b）所示的方式组装这4个片段。 将输入的序列片段进行两两比对，但是这里序列比对的目标与基本的两两比对算法有所不同，现在的目标是寻找一个序列的尾端（后缀）与另一个序列的前端（前缀）相同（或者非常相似）的部分。这实际上是一种局部序列比对，即将一个序列的后缀与另一个序列的前缀进行对比，忽略两端的空白字符。指导片段组装的因素就是片段之间的覆盖。所谓片段之间的覆盖是指一个片段的末端与另一个片段的前端相同（或相似）的部分。通过各个片段之间的覆盖，可以将所有片段连接起来。这实际上相当于将每个片段进行相对定位，得到各片段的布局，逐步确定目标序列。这也可以看成是序列片段的多重比对。图3.21（b）横线下面的是组装的目标序列，也就是序列组装的结果。对于每一列取出现频率最大的一个字符。 上面的例子是一种理想的情况，而实际上，组装问题非常复杂。除了序列片段很长之外，还有4个主要问题。第一个问题是碱基标识错误，如在序列片段中出现的碱基替换、插入和删除。在图3-22中，待组装的片段有4个，而与上面的例子相比较，在第4个片段上有一个A到G的替换。在实际中，测序碱基标识错误发生的频率大约为1%，发生在3’端的可能性比较大。从图3.22中的例子看出，在一定程度上可以对有标识错误的片段进行组装，但是计算机必须能够处理这些错误，应具有容错功能，在进行子串比较时不一定要求完全匹配，而只要子串达到一定的相似度即可。如果考虑到序列的检测误差，序列片段组装的一个更准确的定义为：给定一组取自特定字母表的字符串集合S，其中的字符串的每个字符具有一定的误差，寻找一个字符串s，使得在s中观察到S的可能性最大。 除了碱基标识错误，还有其它一些类型的错误，如两个不同区域中的片段连接成一个更长的片段，又如实验过程中引入的与目标序列不相关的片段。序列片段组装算法应能够处理这些错误。 序列组装的第二个问题是不知道片段的方向。一个片段可能来自于目标DNA的某一条链，但是我们不知道它究竟来自于哪一条链。如果一个片段是一条链的子串（子序列），那么根据互补原则，该片段的反向互补片段是另一条链的子串。于是，对于一条输入的片段，在进行组装时，既可以用其本身，也可以用其反向互补片段，如图3.23所示。在进行片段组装时，应能够选择正确方向上的片段。 第三个问