靶向干扰Akt对耐顺铂人卵巢癌细胞系SKOV3DDP细胞体外生长的研究.pdfVIP

摘要 摘 要 目的： 通过siRNA靶向沉默Akt基因，探讨其对卵巢癌细胞系SKOV3/DDP细胞生 长的影响作用，为卵巢癌的基因治疗，提供新的实验依据。 方法： 1、采用Lipofectamine 2000脂质体介导法将特异性的Akt siRNA转染入人卵 巢癌SKOV3/DDP细胞，检测siRNA靶向沉默Akt后对卵巢癌细胞生长的影响。 2 、用转染试剂Lipofectamine 2000 包裹不同浓度荧光标记的siRNA （FAM-siRNA ）转染SKOV3/DDP细胞，采用流式细胞仪检测其转染效率，确 定siRNA最佳转染浓度。 3 、筛选有效Akt siRNA片段，实验分为5组：①空白对照组（control ）② Akt siRNA-1 ③ Akt siRNA-2④Akt siRNA-3⑤ 阴性对照组（Negative Control ， NC ）。转染48h后，用实时荧光定量PCR （qRT-PCR ）检测各组Akt mRNA 的表 达情况，筛选出Akt siRNA片段。 4 、Akt siRNA片段转染到卵巢癌SKOV3/DDP细胞后对细胞生长的影响。将 筛选出的Akt siRNA片段经Lipofectamine 2000转染到卵巢癌SKOV3/DDP细胞， 实验分3组：①空白对照组（control ）②Akt siRNA转染组③阴性对照组（Negative Control，NC ）。 5、转染48h后，采用流式细胞仪分别检测各组的细胞周期、细胞的凋亡变 化；CCK8法检测细胞的增殖活性；Western Blot法检测Akt及p-Akt蛋白的表达 水平。 结果： 1、Lipofectamine 2000分别包裹50nM、80nM、100nM的FAM-siRNA转染 SKOV3/DDP细胞6h后，流式细胞仪检测结果示：转染效率都在80% 以上，考虑 lipo2000对细胞的毒害作用，siRNA为50nM时转染效率最佳。 2 、转染48h后，qRT-PCR检测各组Akt mRNA 的表达情况示：3个siRNA片 段组Akt mRNA 的表达水平与control组、NC组比较，表达水平明显下调，差异 有统计学意义（P0.05 ），其中siRNA-2片段降低Akt mRNA 的表达最显著。NC 组与control组相比，无明显差异 （P0.05 ）。本实验选取siRNA片段Ⅱ作为有效 II 万方数据 摘要 的siRNA片段。 3、转染48h后，采用流式细胞仪检测各组的细胞周期，结果示：Akt siRNA 转染组G /G 期所占比例与control组、NC组比较明显上调，S期、G /M期所占比 0 1 2 例与control组、NC 组比较，各期所占比例明显下调，差异均具有统计学意义 （P0.05 ），NC组与control组比较，无明显差异 （P0.05 ）。 4 、转染48h后，采用流式细胞仪检测各组的细胞凋亡，结果示：Akt siRNA 转染组的早、晚期凋亡率，与control组及NC组相比，其凋亡率明显增高，差异 有统计学意义（P0.05 ），NC组和control组相比，无明显差异 （P0.05 ）。 5、转染24h 、48h 、72h后，CCK-8结果示：随着时间推移，Akt siRNA特异