第10章 电泳.ppt

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第10章 电泳

第十章 电泳 Electrophoresis Theory ,Methods and Applications 概述 电泳是指带电颗粒在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象。 电泳技术的高度特异性,使混合物可以进行电泳分析。甚至结晶纯化的样品也可在电泳分析中分出两条带或更多的电泳带。 电泳方法的温和性,对不稳定的生物大分子的分离纯化有时比其它分离技术如沉淀法、离心、层析等更为方便、可靠,甚至可作为具有一定规模的制备方法。 生物大分子迁移的方式 分子的尺寸大小和形状; 分子带电荷的性质与量; 分子的生物学与化学特性。 内容提要 第一节 基本原理 第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳 第三节 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 第四节 聚丙烯酰胺凝胶电聚焦 第五节 蛋白质印迹 第六节 琼脂糖凝胶电泳 第七节 毛细管电泳 第一节 基本原理 生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中,它们的净电荷取决于介质的H+浓度或与其它大分子的相互作用。在电场中,带电颗粒向阴极或阳极迁移,迁移的方向取决于它们带电的符号,这种迁移现象即称为电泳。 一、泳动度 带电颗粒在单位电场强度下泳动的速度称迁移率或泳动度(mobility),可用下式表示: υ d/t dl m = = = E V/l vt 式中m(也可以用U表示):泳动度[cm2/(V·s)]; υ:颗粒泳动速度(cm/s); E:电场强度(V/cm); l:支持物的有效长度(cm); V:实际电压(V); d:颗粒泳动的距离; t:通电时间(s或min)。 电泳后通过测量v、t、d、l,即可计算出被分离物质的泳动度。 被分离的球形分子在电场中所受的力(F)为: F = E Q 式中 E:电场强度,即每厘米支持物的电位降;Q为被分离物所带净电荷。 根据Stoke定律,一球形分子在液体中泳动所受的阻力(摩擦力)F’为: F’=6πrη*υ 式中 η为介质黏度;r:分子半径;υ:分子移动速度。 当这两种力相等时:F=F’,即:EQ = 6πrηυ υ=EQ/6πrη 因为:m= υ/E 所以: m=Q/6πrη 由上式可见泳动度与球形分子半径、介质黏度、颗粒所带电荷有关。 二、影响泳动速度的因素 1. 颗粒性质 带电颗粒在电场中泳动的速度和带电颗粒的净电荷量成正比,与颗粒的半径成反比。 2.电场强度 电场强度越大,则带电颗粒泳动越快。根据电场强度的不同,电泳可分为两种。 (1)常压(100~500 V)电泳 其电场强度为2~10 V/cm。 (2)高压(2000~10000 V)电泳 其电场强度为70~200V/cm。 3. 溶液性质 主要指电极溶液和蛋白质样品溶液的pH值、离子强度和黏度等。 1)pH值 溶液的 pH 偏离分子的等电点愈远,解离度愈大,净电荷愈多,泳动速度越快。 2)离子强度 一般最适合的离子强度在O.02~O.2之间。若缓冲液离子强度过高,则会降低颗粒的泳动速度。 3)溶液黏度 成反比 4.电渗 电泳缓冲液相对于固体支持物的移动称电渗。如纸电泳时,滤纸吸附OH-带负电荷,与纸接触的缓冲液带正电荷向负极移动,会对颗粒的移动造成不良影响,故电泳时,电渗小些为好。 5.焦耳热 电场强度或电极缓冲液离子强度增高,电流强度也增加,不仅降低分辨率,即电泳谱带的展宽和组分的热混和;严重时甚至烧断或熔化支持介质。 6.筛孔 人为控制电泳介质的有效筛孔。根据要求调节、控制基质中交联剂的浓度或筛孔的大小,影响颗粒移动的速度。 内容提要 第一节 基本原理 第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳 第三节 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 第四节 聚丙烯酰胺凝胶电聚焦 第五节 蛋白质印迹 第六节 琼脂糖凝胶电泳 第七节 毛细管电泳 第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE (Polyacrylamide gel electrophoresis) 一、原理 以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳方法。 由于其分辨率高,不仅能分离含有各种大分子混合物,而且可以研究生物大分子的特性;如电荷、分子量、等电点及分子构型。 聚丙烯酰胺凝胶电泳的三个优点: A:可以在天然状态分离生物大分子; B: 可以分析蛋白质与别的生物分子的混合物; C: 电泳分离后仍然保持生物活性。 1.聚丙烯酰胺凝胶的合成 凝胶浓度与被分离物相对分子质量的关系 2.聚丙烯酰胺的聚合及影响因素 ① 化学聚合:以过硫酸铵(AP)为催化剂,以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂,使丙烯

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