第10章 电泳.ppt

第十章 电泳 Electrophoresis Theory ,Methods and Applications 概述 电泳是指带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。 电泳技术的高度特异性，使混合物可以进行电泳分析。甚至结晶纯化的样品也可在电泳分析中分出两条带或更多的电泳带。 电泳方法的温和性，对不稳定的生物大分子的分离纯化有时比其它分离技术如沉淀法、离心、层析等更为方便、可靠，甚至可作为具有一定规模的制备方法。 生物大分子迁移的方式 分子的尺寸大小和形状； 分子带电荷的性质与量； 分子的生物学与化学特性。 内容提要 第一节 基本原理 第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳 第三节 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 第四节 聚丙烯酰胺凝胶电聚焦 第五节 蛋白质印迹 第六节 琼脂糖凝胶电泳 第七节 毛细管电泳 第一节 基本原理 生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中，它们的净电荷取决于介质的H＋浓度或与其它大分子的相互作用。在电场中，带电颗粒向阴极或阳极迁移，迁移的方向取决于它们带电的符号，这种迁移现象即称为电泳。 一、泳动度 带电颗粒在单位电场强度下泳动的速度称迁移率或泳动度(mobility)，可用下式表示： υ d/t dl m = = = E V/l vt 式中m(也可以用U表示)：泳动度[cm2／(V·s)]； υ：颗粒泳动速度(cm／s)； E：电场强度(V／cm)； l：支持物的有效长度(cm)； V：实际电压(V)； d：颗粒泳动的距离； t：通电时间(s或min)。 电泳后通过测量v、t、d、l，即可计算出被分离物质的泳动度。 被分离的球形分子在电场中所受的力(F)为： F = E Q 式中 E：电场强度，即每厘米支持物的电位降；Q为被分离物所带净电荷。 根据Stoke定律，一球形分子在液体中泳动所受的阻力(摩擦力)F’为： F’=6πrη*υ 式中 η为介质黏度；r：分子半径；υ：分子移动速度。 当这两种力相等时：F=F’，即：EQ = 6πrηυ υ=EQ/6πrη 因为：m= υ/E 所以： m=Q/6πrη 由上式可见泳动度与球形分子半径、介质黏度、颗粒所带电荷有关。 二、影响泳动速度的因素 1. 颗粒性质 带电颗粒在电场中泳动的速度和带电颗粒的净电荷量成正比，与颗粒的半径成反比。 2．电场强度 电场强度越大，则带电颗粒泳动越快。根据电场强度的不同，电泳可分为两种。 (1)常压(100～500 V)电泳 其电场强度为2～10 V／cm。 (2)高压(2000～10000 V)电泳 其电场强度为70～200V／cm。 3. 溶液性质 主要指电极溶液和蛋白质样品溶液的pH值、离子强度和黏度等。 1）pH值 溶液的 pH 偏离分子的等电点愈远，解离度愈大，净电荷愈多，泳动速度越快。 2）离子强度 一般最适合的离子强度在O.02～O.2之间。若缓冲液离子强度过高，则会降低颗粒的泳动速度。 3）溶液黏度 成反比 4.电渗 电泳缓冲液相对于固体支持物的移动称电渗。如纸电泳时，滤纸吸附OH-带负电荷，与纸接触的缓冲液带正电荷向负极移动，会对颗粒的移动造成不良影响，故电泳时，电渗小些为好。 5．焦耳热 电场强度或电极缓冲液离子强度增高，电流强度也增加，不仅降低分辨率，即电泳谱带的展宽和组分的热混和；严重时甚至烧断或熔化支持介质。 6.筛孔 人为控制电泳介质的有效筛孔。根据要求调节、控制基质中交联剂的浓度或筛孔的大小，影响颗粒移动的速度。 内容提要 第一节 基本原理 第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳 第三节 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 第四节 聚丙烯酰胺凝胶电聚焦 第五节 蛋白质印迹 第六节 琼脂糖凝胶电泳 第七节 毛细管电泳 第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE (Polyacrylamide gel electrophoresis) 一、原理 以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳方法。 由于其分辨率高，不仅能分离含有各种大分子混合物，而且可以研究生物大分子的特性；如电荷、分子量、等电点及分子构型。 聚丙烯酰胺凝胶电泳的三个优点： A：可以在天然状态分离生物大分子； B: 可以分析蛋白质与别的生物分子的混合物； C: 电泳分离后仍然保持生物活性。 1.聚丙烯酰胺凝胶的合成 凝胶浓度与被分离物相对分子质量的关系 2.聚丙烯酰胺的聚合及影响因素 ① 化学聚合：以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂，使丙烯