分子克隆操作技术注意事项.doc

分子克隆操作技术注意事项 引物设计 设计模板：基因过表达的设计模板为mRNA（根据基因名称和样品种属从NCBI查询）, 启动子（转录调控区域）的设计模板为基因组DNA片段（根据基因名称和种属从UCSC查询，并在NCBI核实序列），DNA甲基化分析（CpG岛，根据基因名称和种属从UCSC查询，并在NCBI核实序列）； 设计软件：Vector NTI用于设计过表达引物，Vector NTI用于设计启动子（转录调控区域）克隆引物；Methprimer用于设计DNA甲基化分析引物（BSP, MSP） 5’和3’端的酶切位点和保护性碱基 所用的载体的多克隆位点（MCS）有，所克隆的序列没有，可以同时做双酶切，我们的酶库有，价格便宜的，加了保护性碱基可以直接进行PCR产物酶切的（详情见《保护性碱基.doc》）； 引物溶解 引物的储液浓度为100μM, 计算加入灭菌水的量； 打开管盖前，必须先12000RPM离心2min,因为引物为粉末，容易飘出; 加入灭菌水溶解前，应稍微打开管盖即可，以免粉末飘出； 引物溶液应-20℃保存； 引物使用的工作液浓度为10μM, 需要多少稀释多少，剩余的应丢弃； PCR 操作注意事项：操作前，应熟知所用PCR酶的说明书，并熟知说明书标示的注意事项（引物、模板和酶的建议用量，变性温度及时间，延伸速度等），PCR是极为灵敏的技术，因此要决定避免交叉污染，注意冰上操作，这样可以提高扩增的特异性； 理解掌握每步操作的原理和注意事项； PCR实验进行前，应考虑以下几个问题：引物的使用量，引物的反应浓度一般为0.2-1μM；模板的用量，各种模板的建议用量参考PCR酶说明书，原则上第一次进行PCR反应时，采取中间值； PCR常见问题及对策 问题 原因 对策 没有任何条带（“白板”） PCR体系中成分是否有遗漏添加 重新进行实验 没有目的条带，但有引物二聚体 反应效率过低，其中原因可能是引物与模板的配比不合适，不是模板加得越多反应效率就越高，退火温度过高，导致引物与模板无法配对 调整引物与模板的配比，一般按照PCR酶的说明书的建议选择合适的引物和模板的添加量，降低退火温度 有目的条带，但产量低 反应效率低，其中原因可能是引物与模板的配比不合适，不是模板加得越多反应效率就越高，退火温度高，导致引物与模板结合配对不稳 调整引物与模板的配比，一般按照PCR酶的说明书的建议选择合适的引物和模板的添加量，降低退火温度 有目的条带，但有其他杂带 反应特异性不高，其中原因可能是引物设计存在缺陷，退火温度较低 提高退火温度，如果目的带与杂带相距较远，产物产量可以满足下游实验需要，可不考虑重新设计引物 长引物退火产生DNA双链 一般通过PCR扩增所需的DNA双链，如果DNA双链胶短（150bp以内），这可以通过合成互补长引物，并在引物两侧预留酶切后的酶切位点，通过变性退火程序即可形成互补的DNA双链，一般在制备shRNA编码框，miRNA过表达或干扰编码框时，可以采取上述策略； 全基因合成 如果通过PCR技术无法获取目标DNA片段，我们一般委托DNA合成公司进行全基因合成，只需告知我们需要合成的序列，并在序列的两侧加上克隆所需的酶切位点，服务公司合成后将克隆至克隆载体中，我们收到重组克隆载体（我们自己需要进行酶切鉴定和测序鉴定），需要利用预留的酶切位点亚克隆至我们的目标载体中，然后进行酶切鉴定和测序鉴定； 琼脂凝胶电泳 作用：PCR产物鉴定，酶切产物鉴定，胶回收纯化PCR或酶切产物； 胶浓度：一般为1%，根据分析产物的大小选择合适的胶浓度； 电压：电压高，泳动速度快，耗时短，但产热量大，容易烧胶，条带模糊，电压低，泳动速度慢，耗时长，但产热量小，条带清晰，应根据实际情况选择合适的电压； 电泳缓冲液：加入电泳缓冲液的量高过胶面1厘米以上，如果进行胶回收时，必须使用新的电泳缓冲液液，这是为了避免污染（电泳槽和胶槽也需清洗干净并用超纯水润洗）和提高回收效率（旧电泳缓冲液的PH环境不利用DNA回收）； 理解掌握每步操作的原理和注意事项； 酶切 DNA的用量：一般使用0.5-1ug, 这样可以保证条带清晰，酶切充分；如果酶切产物中有目的条带小于250bp,使用考虑使用较多DNA进行酶切，否则目的条带不清晰； 限制性内切酶的用量：根据酶的活性单位进行添加，一般1ul酶含10个活性国际单位，可以在1小时内充分酶切1ugDNA，一般酶的用量不能超过酶切体系的1/10体积，否则产生星活性（酶切不特异）； 酶切体系：酶切总体系一般为20-30ul，体系大，可以使抑制酶切的因素稀释，但做琼脂糖凝胶电泳时需要配制较厚的胶，根据DNA的浓度和纯度选择合适的酶切体系； 缓冲液：根据限制性内切酶厂家的要求选择合适的缓冲液（buffer），进行双酶切时，查询厂家