分子生物学实验技术1.doc

分子生物学实验 西北农林科技大学 201. 6  目 录 一、基本操作 实验一 细菌培养 实验二 质粒DNA提取 实验三 琼脂糖凝胶电泳 实验四 质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 实验五 聚合酶链?式反应（PCR）技术体外扩增DNA 实验六 植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 二、目的基因获取 实验 植物RNA提取、定量及电泳分析 实验 RT-PCR扩增目的基因cDNA 三、目的基因的克隆和表达 实验质粒载体和外源DNA的连接反应实验十 感受态细胞的制备及转化 实验十一 克隆的筛选和快速鉴定 实验十二 地高辛标记的Southern杂交 实验报告 在完成实验后，必须书写实验报告。一份满意的实验报告必须具备准确、客观、简洁、明了四个特点。写好实验报告除了正确的操作程序外，还必须有赖于仔细的观察及客观的记录，有赖于运用所掌握的理论知识对实验现象和结果的分析和综合能力。 实验报告的格式包括以下几方面： 1.实验的目的和原理 简单扼要地说明进行本次实验的目的和原理。对实验中所用的技术和方法，要作简单的介绍。 2.实验操作程序 在充分理解操作步骤和原理上。对整个实验操作过程进行概括性的描述，要求简单明了，避免长篇抄录。 3.结果处理 对实验过程中出现的现象仔细观察，对数据客观记录。然后再进行处理计算等，得出结果。 4.讨论 这是实验报告中最重要的一部分。首先要对实验结果的准确性进行分析确认，对实验中的误差或错误加以分析，然后综合所观察到的各种现象和数据，做出结论。在此基础上，应运用相关的理论知识及参考文献，结合实验目的、要求进行讨论。对实验中出现的新问题可提出自己的看法，并对自己的实验质量做出评价。 实验一 细菌的培养 一、目的 学习细菌的培养方法及培养基的配置。 二、原理 在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。特别是常用的大肠杆菌。 大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。此时菌体密度可达到1×109~2×109/mL。 培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。实验室中最常用的是LB培养基。 三、实验材料、试剂与主要仪器 实验材料 大肠杆菌 试剂 1. 胰蛋白胨 2. 酵母提取物 3. 氯化钠 4. 1mol/L NaOH 5. 琼脂粉 6. 抗生素（氨苄青霉素、卡那霉素等） （三）仪器 1. 培养皿 2. 带帽试管 3. 涂布器 4. 灭菌锅 5. 无菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌牙签等） 6. 恒温摇床 四、操作步骤 （一）LB培养基的配制 配制每升培养基，应在950m1去离子水中加入： 细菌培养用胰蛋白胨 10g 细菌培养用酵母提取物 5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质完全溶解，用1mol/L NaOH调节pH位至7.0。加入去离子水至总体积为lL，在15 lbf／in2 (1.034×105Pa)高压下蒸气灭菌20分钟。 这样得到是LB液体培养基。LB固体培养基是在其液体培养基的基础上另加琼脂粉15g/L。 （二）细菌的培养 （１）在液体培养基中培养 1.过夜培养 ⑴取5ml液体培养基加入一只无菌的试管中。 ⑵用接种环或灭菌牙签挑一个单菌落，接种于培养液中。 ⑶盖好试管，在摇床上以60r/min速度，于37℃过夜培养。 ２.大体积培养 ⑴按1∶100（V/V）的比例将过夜培养物加入到一无菌烧瓶中，烧瓶的体积应该是培养液体积的5倍以上。 ⑵于37℃，约200r/min剧烈摇动培养。 （２）在固体培养基中培养 细菌在固体培养基上培养主要是为了获得单菌落和短期保存。 平板划线法分离单菌落 ⑴采用无菌技术，用接种环将接种物从平板的一侧开始划线。 ⑵重新消毒接种环，从第一划线处将样品划线至平板的其余部分，重复划线直至覆盖整个平板。（见下图） ⑶于37℃培养直至长出单菌落。 实验二 质粒DNA的提取 一、目的 学习碱裂解法提取质粒的原理 二、原理 质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，具有双链闭环结构的DNA分子。它具有自主复制能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。目前，经人工改造的质粒已广泛用作基因工程中目的基因的运载工具——载体。 质粒DNA的提取是依据质粒DNA分子较染