分子生物学常用检测技术.ppt

全国高等学校医学规划教材－分子诊断学 * * * * * * * * 分子生物学常用检测技术及临床应用 DNA—四种核苷酸（A-T-C-G)组成的多聚骨架 所有组成DNA的核苷酸dATP,dTTP, dCTP,dGTP 都由三种成分组成： 1）一个2’-脱氧核糖（戊糖） 2）一个含氮碱基 嘌呤：A\G 嘧啶：T/C 3）三个磷酸基团 各单个核苷酸由5’和3’-碳形成的磷酸二酯键连接在一起 变性、复性、退火和淬火 基因 分子生物学常用技术 PCR（聚合酶链式反应） 核酸分子杂交 基因芯片技术(biochip) DNA 测序（DNA sequencing ） DNA重组技术(DNA recombination) 一、聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction ，PCR） 体外基因扩增技术 特异性强 灵敏度高 操作简单、省时 对待检原始材料质量要求低 高效率的基因扩增技术 （一）PCR原理 原理 双链DNA 变性 退火 链延伸 （膜板） （双链分成单链） （膜板与引物杂交） （DNA合成） 不断重复 PCR反应体系 Mg2+ Mn2+ dCTP dGTP dTTP dATP Taq DNA 聚合 酶 模板 引 物 和 或 和 （二）PCR反应的设计及影响因素 PCR的种类 荧光定量PCR 通用引物PCR 多重PCR 巢式PCR RT-PCR 原位PCR 免疫PCR …… TaqMan探针 reverse primer R Q forward primer 3 3 5 5 3 5 5 1. Polymerisation probe R Q 3 3 5 5 3 5 5 2. Strand displacement Q 3 3 5 5 3 5 5 3. Cleavage R 3 5 5 3 5 5 4. Polymerisation completed Q R R = Reporter Q = Quencher 3 荧光定量PCR 定量PCR的数学原理 PCR 理 论 方 程 N = N0 x (1+E)n N：扩增数量 N0：起始模板数量 E：扩增效率 N：循环数 Log [DNA] 循环数 线性增长期Linear 平台期Plateau y = N0 (1+e)n 指数增长期Geometric 定量PCR的数学原理 Rn (荧光强度) 循环数Cycle Number 指数增长期 平台期 CT = - k logN0 + b Ct?（Cycle threshold）值：是指每个反应管内的荧光信号到达设定域值（threshold）时所经历的循环数。 PCR的临床应用 对病原微生物核酸进行快速检测 弥补免疫检测的缺陷 缩短诊断的窗口期（如HBV,HIV） 用于药物疗效监测和评估 用于肿瘤基因表达方面的研究 用于遗传病的诊断 项目 标本采集 HBV 无菌注射器抽取2毫升静脉血或其它体液注入无菌试管或抗凝管。 HCV EB 1.鼻咽拭子或体液标本。 2.也可取抗凝血标本,但一般不推荐。 CMV 1.尿液：中段晨尿20ml于加盖试管。 其他体液标本或咽拭子。 也可取抗凝血标本,但一般不推荐。 TB 1.痰液：患者深部咳痰1～3ml于无菌加盖试管。 2.其他组织标本：留于无菌试管。 3.也可取抗凝血标本,但一般不推荐。 MP 呼吸道病毒 咽拭子 样本采集要求 项目 标本采集 所需容器 CT 男性： 尿道分泌物：细小棉拭子伸入尿道约2～4厘米，旋转数圈取出分泌物（应略带粘膜）。 前列腺液、精液。 女性： 阴道分泌物：用无菌生理盐水洗去宫颈外分泌物，再用无菌棉拭子插入宫颈内，停5秒后旋动棉拭子采取分泌物。 尿道分泌物：同上 一次性无菌带盖的试管。 NG UU TP HPV HSV 二、核酸分子杂交 根据核酸变性和复性的原理，不同来源的变性单链核酸分子在合适的条件下，通过碱基互补形成双链杂交体的过程称为核酸分子杂交（molecular hybridization）。 1、遗传病的诊断 2、病原体的鉴定 3、癌基因突变的检测 4、组织配型 5、亲子鉴定 核酸分子杂交的临床应用 三、基因芯片技术 基质材料分，有尼龙膜、玻璃片、塑料、硅胶晶片、微型磁珠等。 用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列 原位合成法在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列 基因芯片技术的应用 1、药物筛选和新药开发 2、疾病诊断 3、环境保护 4、司法 5、现代农业 全国高等学校医学规划教材－分子诊断学 * * * * * * * *