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液相色谱基本常识一．色谱法的原理利用混合物中各组份在不同的两相中溶解,分配,吸附等化学作用性能的差异,当两相作相对运动时,使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离。两相中有一相是固定的,叫作固定相,也就是咱们的色谱材料；有一相是流动的,称为流动相,流动相又叫洗脱剂。二．色谱类型1.按流动相的物态分气相色谱(Gas Chromatography, GC)-用气体作为流动相(又叫载气)。液相色谱(Liquid Chromatography, LC)-用液体作为流动相(又叫洗脱剂)。2.按固定相的形态分:（1）平面色谱：纸色谱、薄层色谱。（2）柱色谱三．定义1.定义高效液相色谱法：是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的高效能分离手段。组成：高性能色谱柱，高精度输液泵，高灵敏度检测器2.特点优点：高效(60000理论塔板/米)、高速(1~10mL/min)、高灵敏度（微升数量级），高压(150~300kg/cm2)、高精度、高自动化高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。缺点：仪器设备价格昂贵3.高效液相色谱柱发展史19世纪70年代中期，HPLC仪开始出现，主要填料：10 μm的无定型硅胶颗粒。70年代后期，发展了反相液相色谱。80年代，HPLC 被广泛应用于化合物的分离，主要填料：粒径为5 ～ 10μm 球形硅胶。90年代早期，粒径为5 μm的高纯硅胶，即所谓的B 型硅胶被发展，并成为这个行业填料的标准，这种B 型硅胶含有微量的金属。90年代后期，为了满足快速分离的需求，发展了3 μm或3.5 μm的球形硅胶，其作用和性能逐渐的获得了人们的认同和接受。21世纪早期，为适应超快速的分离要求，粒径小于2 μm的填料被开发出来，发展出了整体柱、无机和有机杂化硅胶。目前，市场上流行的分析用的HPLC 硅胶基质填料主要为B 型硅胶。4. 高效液相色谱柱的基质材料（1）硅胶优点：目前应用最为广泛的基质材料。高机械强度和高的比表面积。可利用直接的广泛的表面键合反应来满足正相、反相、离子交换、疏水作用色谱和体积排除色谱的需求。重现性好。pH 适用范围为pH 2－8。缺点：具有容易导致强碱性物质拖尾的，表面活性和带酸性的硅羟基。（2）聚合物：交联苯乙烯、二乙烯基苯和甲基苯烯酸酯优点：pH 稳定性好：pH1－13。可以在很宽的范围内进行表面化学处理以满足反相色谱、离子交换色谱、疏水作用色谱和体积排阻色谱的需求。在中等pH 条件下对强碱性物质具有更好的峰形。缺点：填料的体积随着流动相的不同而改变，如膨胀或收缩。分离效率相对硅胶而言比较低。重现性不好。5.色谱柱的分类常见的分配柱填料：碳十八柱（ODS/C18)、碳八柱（MOS/C8）、碳六柱（Hexyl/C6）、碳四柱（Butyl/C4）、碳一柱（Methyl/C1）、阴离子交换柱（SAX)、阳离子交换柱（SCX）、苯基柱（Phenyl）、氨基柱（Amino/NH2）、氰基柱（Cyano/CN/Nitrile）常见的吸附柱填料：硅胶柱、氰基柱、氨基柱HPLC色谱操作注意事项1．流动相（1）流动相应选用HPLC试剂、高纯水或双蒸水，酸碱液及缓冲液需经过滤后使用，过滤时注意区分水系膜和油系膜的使用范围；（2）流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。（3）水相流动相需经常更换（一般不超过2天），防止长菌变质；（4）使用双泵时，A、B、C、D四相中，若所用流动相中有含盐流动相，则A、D（进液口位于混合器下方）放置含盐流动相，B、C（进液口位于混合器上方）放置不含盐流动相；2.样品（1）样品必须经过0.45μm或0.22μm的滤膜过滤，确保样品中不含固体颗粒；（2）用流动相或比流动相弱（若为反相柱，则极性比流动相大；若为正相柱，则极性比流动相小）的溶剂制备样品溶液，尽量用流动相制备样品液；（3）手动进样时，进样量尽量小，使用定量管定量时，进样体积应为定量管的3～5倍；（4）每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂(如甲醇)等清洗进样器。3．色谱柱（1）使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书，注意适用范围，如pH值范围、不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品；（2）连接色谱柱时，应注意连接方向，防止反接、反冲色谱柱；（3）使用保护柱；（4）长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)。（5）常规C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。（6）不要高压冲洗柱子；（7）不要在高温下长时间使用硅胶键合相色谱柱；使用过程中注意轻拿轻放。4.操作过程1．注意各流动相所剩溶液的容积设定，若设定的容积低于最低限会自动停泵，注意洗泵溶液的体积，及时加液；2．使用过程中要经常观察仪器工作状态，及时正确处理各种突发事件。3．堵塞导致压力太大，按预柱→混合