分生实验(一).ppt

与DNA分子量标准物（Marker）比较能大概判断未知DNA的分子量 质粒DNA为环状，在酶切彻底的情况下，DNA片段数与酶切位点数目相同 2.质粒DNA的酶切鉴定 取一只1.5mL EP管加入以下试剂： 酶切混合液：15 μL 质粒DNA：5 μL 混匀后，置37 ℃过夜保温，反应结束后4 ℃放置备用。 下次实验：PCR技术及应用 P163 质粒DNA酶切鉴定的原理 Marker 质粒DNA过夜酶切 操作步骤(Methods) 分组：4人/组，每组提取两种质粒（空载及重组质粒） 1.质粒的提取 （1）接种一个单菌落（single colony）于5 mL含相应抗生素的LB培养基中，37℃振荡培养至饱和状态（A600=0.4）或过夜。（教师准备） （2）取1.5 mL离心管一支，加入1.4 mL菌液，13 000 r/min离心1 min去掉上清液。加入150 μL 的溶液Ⅰ，充分混悬细菌，在室温下放置10 min。 （3）加入200 μL新配制的溶液Ⅱ。加盖，颠倒5次使之混匀。冰上放置5 min。 （4）加150 μL预冷的溶液Ⅲ，加盖后颠倒5次混匀，冰上放置15 min。13 000 r/min离心5 min，取400 μL上清液移入另一离心管中。 （5）向上清液中加入等体积苯酚/氯仿，震荡混匀，13 000 r/min离心2 min，300 μL上清液转移至新的离心管中。 （6）向上清液中加入等体积无水乙醇，混匀，室温放置2 min。离心5 min，倒去上清乙醇溶液，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 （7）加入1 mL 70 %乙醇，震荡并离心， 13 000 r/min离心2 min，倒去上清液，晾干，加入20 μL的 TE缓冲液，使 DNA完全溶解，待用。 * * * 左下角处有超级链接到配伍末端 1.每个实验室分4组完成实验设计。（请带教老师帮同学按学号顺序分好组，并在登分册上注明分组情况） 2.每组同学集体讨论,完成实验设计，以PPT的形式上交并在实验课上作汇报。 设计性实验具体内容见实验室粘贴的纸质材料 PPT首页格式如下： 关于实验设计的相关通知 2011级本科生化及分子生物学实验设计 年级、专业、班级： 实验课时间： 实验室： 组别： 组员排名： 报告人： 3.评分标准 （1）根据问题回答的正确性、实验设计的合理性及可行性、汇报的流畅性（每组汇报时间限20分钟）将按要求完成的实验设计成绩分为优（9.5）、良（9）、中（8.5）三等。 如实验设计没能按要求完成，将酌情给低于8.5的成绩。 （2）各组自行将组员按实际贡献大小依次排名，成绩从第一名往后依次递减0.2分，汇报人有0.3的加分。 实验一 质粒提取及酶切鉴定 P158 基因工程（genetic engineering）是指采用人工方法将不同来源的DNA进行重组，并将重组后的DNA引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程。 相关基础知识 目的基因 工具酶 载体 基因工程相关物质 质粒 存在于细菌细胞内、染色体外、共价闭合的 小型环状DNA分子(covalent closed circular DNA)。 具有自我复制功能。 带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物 经改造后具有多克隆位点。 质粒 (plasmid) 特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状 限制性核酸内切酶： ------基因工程的手术刀 是分子生物学研究中的一种工具酶，能识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。 如：EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列和切口是： ? EcoRⅠ：G↓AATTC ? HindⅢ：A↓AGCTT 概念 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统（restriction-modification system），限制外源DNA， 保护自身DNA。 作用 分类 酶结构、作用、识别及切割特异性的不同 分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，基因工程技术中常用Ⅱ型 Ⅰ型酶具有限制和DNA修饰作用，且识别及切割位点不同（下游100-1000bp） Ⅲ型酶具有限制和DNA修饰作用，识别及切割位点不同（相距较近） （1）识别及切割位点相同 （2）识别序列通常为4～8bp的回文结构； （3）切割可产生两类切口，三种末端。 Ⅱ型限制酶特点 Ⅱ型酶识别序列特点— 回文结构(palindrome) 切口 ：平端切口、粘端切口 GGATCC CCTAGG Bam HⅠ GTC CAG G CCTAG GATCC G + GGATCC CCTAGG HindⅡ GTCGAC CAGCTG