第四章 酶法分析.ppt

第四章 酶分析法 5 高度的不稳定性 6 反应条件温和 7 酶活性可调性 第三节 酶法分析 一 酶法分析的原理 终点法的原理：根据被测物的性质，选择适宜的工具酶对该物质进行作用，然后在反应完成后，借助理化方法测出其总变化量，并参考反应的平衡点，计算出被测物的实际含量或浓度的一种分析方法。 单酶反应定量法原理 S E P B. 指示酶偶联定量法原理 利用偶联的酶及辅酶的改变，作为酶反应完成的定量指示剂，常用两种辅酶。 2. 反应速度法原理 通过条件控制，分别使底物，辅酶活化剂或抑制剂的浓度在酶反应中对反应速度起主导作用，这时酶反应速度和上述相应因素的浓度间将具有确定的比例关系，测定酶反应的速度就可以求出它们的浓度。 被测物是酶的底物（测酶的反应速度） 被测物是辅酶（反应速度与辅酶浓度呈正比关系） 被测物为激活剂（测酶反应速度） 被测物是抑制剂（分不可逆和可逆） 二. 酶法分析的检测方法 1.分光光度法及荧光法（利用底物与反应物在紫外和可见光部分吸光度的不同，连续测定反应一定时间内吸光度的变化。 2. 电化学方法（电位计，极谱法） 3. 其它方法（测压法，量热法） 三.终点测定法（总变量分析法） 1. 终点法测定条件 A. 酶的底物特异性 B. 反应的平衡 C. 反应中的酶量 D. 反应产物抑制 重要条件：被测物底物的浓度要很小；其它因素要处于最佳水平，双底物反应的另外一个底物要有足够高的浓度；酶的用量要高。 2. 终点法的种类 A. 单酶反应 底物减少量的测定；产物增加量的测定，辅酶变化量的测定。 B. 指示酶偶联定量法 以脱氢酶为指示剂 例4-7 丙酮酸、磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、D-2磷酸甘油酸(D-2-PGA)的定量测定。（在一个比色杯内进行）。 丙酮酸+NADH+H+ 乳酸脱氢酶 乳酸+NAD+ PEP+ADP 丙酮酸激酶 丙酮酸+ATP D-2磷酸甘油酸(D-2-PGA) 烯醇化酶 PEP 以脱氢酶以外的酶做指示剂 例4-8 D-葡萄糖的定量测定 D-葡萄糖+2H2O+O2 COD D-葡萄糖醛酸+2H2O2 2H2O2+DH2 过氧化物酶 2H2O+D 四 反应速度法 A. 利用做底物的测定法； B. 利用辅酶或抑制剂作用的测定方法； C. 特殊的反应速度测定法 2.专一性不可逆抑制 此属抑制剂专一地作用于酶的活性中心或其必需基团，进行共价结合，从而抑制酶的活性。有机 磷杀虫剂能专一作用于胆碱酯酶活性中心的丝氨酸残基，使其磷酰化而不可逆抑制酶的活性。当胆碱酯酶被有机磷杀虫剂抑制后，乙酰胆碱不能及时分解成乙酸和胆碱，引起乙酰胆碱的积累，使一些以乙酰胆碱为传导介质的神经系统处于过度兴奋状态，引起神经中毒症状。解磷定等药物可与有机磷杀虫剂结合，使酶和有机磷杀虫剂分离而复活。 (二)可逆性抑制(reversible inhibition) 抑制剂与酶以非共价键结合，在用透析等物理方法除去抑制剂后，酶的活性能恢复，即抑制剂与酶的结合是可逆的。 1.竞争性抑制(competitive inhibition) (1)含义和反应式 抑制剂I和底物S结构相似，抑制剂I和底物S对游离酶E的结合有竞争作用，互相排斥，已结合底物的ES复合体，不能再结合I。同样已结合抑制剂的EI复合体，不能再结合S。 （2）特点： ① 抑制剂I与底物S在化学结构上相似，能与底物S竞争酶E分子活性中心的结合基团. 例如，丙二酸、苹果酸及草酰乙酸皆和琥珀酸的结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。 ②抑制程度取决于抑制剂与底物的浓度比、 〔ES〕和〔EI〕的相对稳定性； ③加大底物浓度，可使抑制作用减弱甚至消除。 （3）竞争性抑制剂的动力学方程 E+S ES E+P E+I EI k1 k2 k3 由米氏方程得：Km＝ ① Ki＝ ② 〔E〕＝〔E〕t－〔ES〕－〔EI〕 ③ 〔E〕〔S〕 〔ES〕 〔E〕〔I〕 〔EI〕 ki 解方程①②③得： 〔ES〕= 〔E〕t （1 + ）＋1 Km 〔S〕 〔I〕 Ki 又因vi＝k3〔ES〕,代入上式得： Vi＝ （1 + ）＋〔S〕 Km 〔I〕