第八章20104miRNA试卷.ppt

miRNA and Cancer Comparison of small RNAcharacterization methods MicroRNA Quantitation by RT-PCR MicroRNA Quantitation by RT-PCR SBC-miRNA microarry hybridization result Scanner=GenePix 4000B Wavelengths=635,532 PMTGain=650,600 扫描像素值： 5μm，PMT(%)数值： 100 肝癌－CY5 癌旁－CY3 MIR-122a为肝标志小RNA MIR-19b为癌标志小RNA Scanner=GenePix 4000B Wavelengths=635,532 PMTGain=650,600 扫描像素值： 5μm PMT(%)数值：100 肝癌－CY5 癌旁－CY3 MIR-122a为肝标志小RNA MIR-155,20a ,let7 family为癌 标志小RNA siRNA 小的干涉RNA（small interfering RNA; siRNA）和微小RNA（microRNA；miRNA）是两种序列特异性地转录后基因表达的调节因子，是小RNA的最主要组成部分，它们的相关性密切，既具有相似性，又具有差异性。对小RNA的深入研究将使我们更深一步了解生命的奥秘。 RNA干涉（RNAi）在实验室中是一种强大的实验工具，通过这种方式，利用具有同源性的双链RNA（dsRNA）诱导序列特异的目标基因的沉默，迅速阻断基因活性。 小的干涉RNA（siRNA）是在RNA干涉过程中人工体外合成的小片段RNA，由约20个碱基对组成，包括5个磷酸根，2个核苷和3个悬臂。 在哺乳动物中利用小的干涉RNA和短发夹RNA（short hairpin RNAs，shRNA）来进行RNA干涉以使基因沉默已经成为强大而有力的生物工具。 图1 dsRNA可以沉默目标基因。 在植物中，通过注入人工合成的RNA病毒或者是插入反向重复序列可以诱导目标基因沉默。在线虫中，沉默也可以用注射dsRNA的方式来诱导。这两种生物体中，沉默是系统的并且传遍全身。 a) 沉默信号从脉杆传到叶片组织。绿色是绿色荧光蛋白；红色是叶绿素荧光，可以在绿色荧光蛋白被沉默后看出。 b,c）通过实验，使得线虫的核中表达绿色荧光蛋白。实验者在左边加上对照dsRNA，右边加上绿色荧光蛋白的dsRNA。一些神经元核仍然可以检测到荧光，对应于少量的蛋白质表达。 c）Hela细胞加上ORC6 siRNA之后，针对微管蛋白（绿色）和DNA（红色）进行染色。ORC6的去除导致多核细胞的积累。稳定的沉默也可以通过表达发夹结构或者折回的双链RNA的表达来实现。 d）当和野生型的果蝇相比（右边），成体果蝇中表达控制白色基因的发夹同源物（左边）导致眼睛丧失色素。 1999年， Hamilton等在植物基因沉默的研究中首次发现21～25nt 的dsRNA 的出现对转基因导致基因沉默十分重要，而在转基因正确表达的植株中则未出现。 随后，Hammond 等进行的细胞提取物核酸酶活性实验证明了小分子RNA在RNAi 中的作用，这些小分子RNA就是由dsRNA形成的siRNA。 RNAi能够调节和关闭基因的表达，进而调控细胞的各种高级生命活动。 RNAi的发现不仅提升了人们对RNA分子的认识，还大大推进基因功能的研究，更为各种类型的传染病和癌症提供了一种新的手段。 近年来，有关RNAi研究成果令人眼花缭乱：人们利用RNAi途径来人为调节特定基因的表达以达到治疗遗传疾病甚至癌症的目的，而且已经有不少的成功信息公布。………… siRNA是RNAi途径的主要作用物,miRNA和siRNA很容易混淆，他们有许多共同点也有许多不同点。 相同点/联系点 siRNA miRNA 长度及特征 都约在22nt左右，5’端是磷酸基，3＇端是羟基 合成的底物 miRNA和siRNA合成都是由双链的RNA或RNA前体形成的 Dicer酶 依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点 Argonaute家族蛋白 都需要Argonaute家族蛋白参与 RISC组分 二者都是RISC组分，所以其功能界限变得不清晰，如二者在介导沉默机制上有重叠；产生了on target和off target的问题 作用方式 都可以阻遏靶标基因的翻译，也可以导致mRNA降解，即在转录水平后和翻译水平起作用 进化关系 可能的两种推论：siRNA是miRNA的补充，miRNA在进化过程中替代了siRNA 不同点/分歧点 siRNA miRNA 机制性质 往往是外源引起的，如病毒感染和人工插入dsRNA之后诱导而产生，属