动物寄生虫病PCR诊断技术.doc

动物寄生虫病PCR诊断技术 聚合酶链反应（）是一种既敏感又特异的DNA体外扩增方法，可将一小段目的DNA扩增上百万倍，其扩增效率可检测到单个虫体的微量DNA。通过设计特异引物，扩增出特PCR产物特异性而且操作过程也相对简便快捷，无需对病原进行分离纯化；同时可以克服抗原和抗体持续存在的干扰，直接检测到病原体的DNA，既可用于临床诊断，又可用于流行病学调查。thylene diaminetetra acetic acid，EDTA）、十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS）、三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸（Tri (Hydroxymethyl) Aminomethane-HCl，Tris-HCl）、氯化钠、蛋白酶K（25μg/μl）、异丙醇（80%）、双蒸水、灭菌超纯水等。 (2) DNA裂解液：500 mM NaCl 70 μl 、100 mM Tris-HCl（pH 8.0）30 μl、50 mM EDTA（pH 8.0）150 μl、10%SDS 30 μl。 (3) WizardTM DNA Clean-Up 试剂盒或类似的DNA提取试剂盒。 （二）PCR扩增及琼脂糖电泳 1．材料。 提纯的虫体DNA。 2．器具。 超净工作台、微型高速台式离心机、微量取液器（2/20/200/1000 μl）、PCR扩增仪、琼脂糖电泳系统、凝胶成像系统、微波炉、4℃/-20℃冰箱、紫外透射仪、微型离心管（200/500/1500 μl）、有机架、一次性手套、透明胶带、量筒（100 ml）、三角瓶（500 ml）等。 3．试剂。 (1) 10×PCR Buffer（无Mg2+）、dNTP（2.5 mM each）、ddH2O 、MgCl2（25 mM）、Primers、Ex Taq酶（5 U/(l）、琼脂糖、EB（10mg/ml）、Tris碱、硼酸（Boric acid）、去离子水、EDTA（0.5 mol/L，pH 8.0）、10×载样缓冲液。 (2) 0.5×TBE缓冲液：准确秤取Tris碱5.4g，硼酸2.75g，充分溶解于800 ml去离子水中，加10ml 0.5 mol/L EDTA（pH8.0），用去离子水定容至1000ml。 （三）PCR扩增产物的纯化 1．材料。 PCR扩增产物。 2．器具。 TGL-16G高速台式离心机；三用电热恒温水箱；微量取液器（2/20/200/1000 μl）、琼脂糖电泳系统、微波炉、电子天平、4℃/-20℃冰箱、紫外透射仪、微型离心管（500/1500 μl）、有机架、透明胶带、一次性注射器、量筒（100ml）、三角瓶（500ml）、手术刀、保鲜纸等。 3．试剂。 琼脂糖；0.5×TBE缓冲液；UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒；UNIQ-10柱式PCR产物纯化试剂盒；异丙醇（80%）等。 三、实验方法、步骤和操作要领 (一) 寄生虫基因组DNA的提取及纯化 1.实验原理。 应根据研究目的来决定是从单个虫体还是多个虫体提取基因组DNA。寄生虫虫体的各个部位都可以作为基因组DNA的抽提材料，如果虫体较大的话可取其中部而保存其头部及尾部，以备形态学鉴定以验证其种类。如果虫体较小（小于1 cm），则应使用整条虫体抽取DNA。若虫体特别细小（例如幼虫），可用多条虫体来提取DNA。为了获得高含量、高纯度的DNA，最好使用新鲜材料。从冻干或50%-70%乙醇保存的寄生虫材料中也可较容易地提取DNA。 寄生虫DNA的抽提方法有多种，不同种类的寄生虫虫体都有其最适合的抽提方法，但各种方法的基本原理都一样，即先用机械的方法将虫体组织破碎，然后加入DNA裂解液和蛋白酶K，充分作用后，虫体组织中的细胞膜破裂，蛋白质变性，将虫体基因组DNA释放到溶液中。在裂解过程中，虫体细胞碎片及大部分蛋白质会相互缠绕成大型复合物，后者被DNA裂解液中的SDS包盖，通过离心沉淀，这些复合物会从溶液中沉淀下来，变性剂也同时被除去，从而就可从上清中回收虫体基因组DNA溶液。回收后的虫体基因组DNA液用WizardTM DNAml的离心管中。若虫体较小，取一整条虫体经如上洗涤处理。 对于鸡球虫，将保存在2.5%重铬酸钾溶液的卵囊悬液以2000×g离心10min，弃重铬酸钾溶液。以双蒸水重悬，同法离心洗涤三次后，用20%次氯酸钠处理卵囊20min，2000×g离心沉淀卵囊，用适量饱和盐水重悬卵囊沉淀，1500×g离心10min，上清液加入4倍体积的灭菌双蒸水，3000×g离心10min。卵囊沉淀再用上述方法重新漂浮、洗涤一次。用少量灭菌双蒸水重悬卵囊沉淀，然后将其轻轻地加在0.6M无菌蔗糖溶液之上，2000×g离心5min，取上层卵囊加5倍体积的水，3000×g离心10min，沉淀再用无菌蔗糖溶液漂浮一次，