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GUS酶活性测定概要1
荧光分析法测定植物体内GUS酶活性
反应原理
4-MUG (4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide) (C16H16O9 ), 4-甲基伞型酮-β-葡萄糖醛酸苷) 分子量:352.3, CAS:6160-80-1
4-MU(4-methylumbelliferone), 4-甲基伞型酮, 分子量:176.2, CAS号:90-33-5
GUS酶活性
(pmol 4-MU/hr/ug protein)
反应底物(4-MU)的物质的量
反应时间*蛋白含量
注:
4-MU的浓度是由荧光分光光度计测得数值后从标准曲线上读数获得;
反应时间可以设置梯度时间:5min、10min、20min、30min、45min和60min等, 也可以只取一个时间;
蛋白浓度是通过考马斯亮蓝法测得吸光度后从BSA标准曲线读数获得。
反应底物(4-MU)的浓度*(体积)
反应时间*蛋白浓度*(体积)
测定原理
GUS酶提取
取植物样品(叶、根)20mg于预冷的1.5mL eppendorf管中,加入液氮研磨成粉末,加入200uL的提取buffer,混匀;
13000rpm, 4℃离心15min,吸取上清于另一eppendorf管中4℃备用。可以做几个平行。
MU标准曲线的制作
用反应终止液将MU母液(1mM)稀释成浓度范围在0-10uM的系列标准液,通过测定它们的荧光强度作出一条标准曲线。
具体步骤:
配置4-MU 1mM的母液,称取0.04404gMU用stop solution定容到250ml;
配制4-MU梯度浓度液(由反应终止液配制);
在激发光365nm,发射光455nm,狭缝3nm条件下,测定各样品的荧光值,绘制标准曲线。
实验注意事项:
4-MU梯度浓度液的配置时需要根据预估样品的浓度范围来确定,要求是4-MU的浓度梯度要跨过样品的浓度范围。
预估时可以参考一下数据:
0.05nmol的MU的荧光强度是843; 0.1nmol是1968; 1.5nmol是56247
蛋白标准曲线的制作
BSA母液(100ug/ml),分别吸取:0ul, 10ul, 20ul, 30ul, 40ul, 50ul, 60ul, 70ul, 80ul, 90ul, 100ul,150ul, 200ul, 300ul, 400ul.用水补到1ml,加入3ml的G250.反应半小时后比色.(BSA的质量分别为0 ug,1 ug ,2 ug ,…….15 ug,20 ug ,30 ug ,40ug)
以吸光度-蛋白含量做标准曲线图。
样品GUS酶活性测定
样品蛋白含量的测定:取出提取的上清液20ul加双蒸水定到1ml,加入3毫升的G250 室温反应至少5min,但是不要超过1h,一般是半个小时后,用分光光度计来测定吸光度 (595nm)后从标准曲线上读数;
设定时间内的4-MU浓度测定:取10ul蛋白上清,加入390ul反应缓冲液里(37℃预热),立即取100ul加入到900ul反应终止液(0时的空白对照),37℃温浴,严格定时,10min, 30min和60min各取100ul,加入900ul反应终止液。测定荧光值。根据标准曲线,计算各样品产物浓度;
最后根据公式算出酶活性。
实验中涉及到的溶液的配置
1、Extraction buffer :
0.1M 磷酸缓冲液(PH7.0)
50ml
10% SDS
1ml
0.5M EDTA(PH8.0)
2ml
Triton X-100
100ul
β-巯基乙醇
100ul
ddH2O
up to 100ml
2、GUS assay buffer :
称取22mg 4-MUG于50ml的GUS extraction buffer中,4℃保存。
3、Stop solution:
0.2M Na2CO3
4、G-250 dye:
coomassie blue G250
20mg
95% 乙醇
10ml
磷酸
20ml
ddH2O
up to 200ml
实验结束后清洗工作:
96孔板用过以后用清水洗净,然后用碱液(氢氧化钠溶液)浸泡一个小时后用清水洗净后烘干后备用.
测蛋白的比色杯用酒精洗净后用清水洗净,烘干后备用.
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