离与观察实验六：叶绿体的分离.ppt

* 实验六：叶绿体的分离与观察 一、实验目的： 通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。 二、实验原理： 分离细胞器的常用方法是将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。 叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行, 以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液1000r/min的条件下离心2min, 以去除其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。然后，在3000r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。分离过程最好在0~5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。叶绿体一直是细胞生物学、遗传学和分子生物学的重要研究对象，是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。 三、实验用品 1、器材： a 主要设备: 普通离心机、组织捣碎机、天平。 b 小型器材:烧杯，量筒，滴管，离心管，纱布，载片、盖片。 2、材料：新鲜菠菜。 3、试剂：0.35mol/L氯化钠溶液。 四、实验方法 1、叶绿体的分离与观察 取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干去除叶梗脉 ↓ 取30克放入150ml氯化钠溶液 ↓ 入组织捣碎机匀浆，低速匀浆（5000r/min）3~5min（破碎细胞） ↓ 匀浆液用6层纱布过滤，取4ml 1000r/min离心2min（去除组织残渣和未被破碎的细胞） ↓取上清 3000r/min离心5min ↓保留沉淀（即混有部分细胞核的叶绿体） 用氯化钠溶液悬浮 ↓ 在光学显微镜下观察 2、菠菜叶手切片观察 新鲜菠菜叶 ↓ 刀片切出一斜面置于载玻片上；或者用镊子轻轻撕下表皮，置于载片上。 ↓ 滴加1~2d氯化钠溶液 ↓ 盖上盖片显微镜下观察 五、实验结果： 1、叶绿体的分离和观察 普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。 2、菠菜叶手切片观察 在普通光镜下可以看到三种细胞： (1)表皮细胞：为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞； (2)保卫细胞：为构成气孔的成对存在的肾形细胞； (3)叶肉细胞：为排列成栅状的长形和椭圆形细胞。叶绿体呈绿色橄榄形，在高倍镜下还可以看到绿色的基粒。 六、作 业 根据徒手切片观察结果，绘制带有叶绿体的菠菜叶的结构模式图。 ●叶绿体的形状，大小，数目 形状：香蕉形（高等植物） 大小：直径3-5?m；厚2-3?m 数目：几百到几千 分离出的叶绿体 菠菜叶手撕片叶绿体及表皮细胞观察 *