第二章固液分离和细胞破碎讲述.ppt

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①反复冻融法:于-15~20℃使之冻固,然后缓慢地融解,如此反复操作,使大部分细胞及细胞内颗粒破坏。由于渗透压的变化,使结合水冻结产生组织的变性,冰片将细胞膜破碎,使蛋白质可溶化,成为粘稠的浓溶液,但脂蛋白冻结变性。 ②冷热变替法:将材料投入沸水中,于90℃左右维持数分钟,立即置于冰浴中使之迅速冷却,绝大部分细胞被破坏。 ③超声波法:超声波作用下液体发生空化作用,产生极大的冲击波和剪切力,使细胞破碎。 ④加压破碎法:加一定气压或水压也可使细胞破碎。 、超声波处理法:用一定功率的超声波处理细胞悬液,使细胞急剧震荡破裂,此法多适用于微生物材料,用大肠杆菌制备各种酶,常选用50-100毫克菌体/毫升浓度,在1KG至10KG频率下处理10-15分钟,此法的缺点是在处理过程会产生大量的热,应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。 无论用哪一种方法破碎组织细胞,都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中,使大分子生物降解,导致天然物质量的减少,加入二异丙基氟磷酸(DFP)可以抑制或减慢自溶作用;加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性,加入苯甲磺酰氟化物(PMSF)也能清除蛋白水解酥活力,但不是全部,还可通过选择pH、温度或离子强度等,使这些条件都要适合于目的物质的提取。 将待破碎的鲜材料在一定pH 和适当的温度下,利用自身的蛋白酶将细胞破坏,使细胞内含物释放出来。比较稳定,变性较难,蛋白质不被分解而可溶化。利用该法可从胰脏制取羧肽酶。自体融解时需要时间,需加少量甲苯、氯仿等。应防止细菌污染。自体融解过程中PH 显著变化,随时要调节pH。自溶温度选在0~4℃,因自溶时间较长,不易控制,所以制备活性蛋白质时较少用。 溶菌酶、蜗牛酶和纤维素酶常用。 * B. 常用过滤设备 (1) 板框压滤机 广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、酵母菌和细菌等多种发酵液的固液分离。适合于固体含量1-10%的悬浮液的分离。 优点:过滤面积大,结构简单,价格低,动力消耗少, 对不同过滤特性的发酵液适应性强。 缺点:不能连续操作,设备笨重,劳动强度大,卫生条件差,非过滤的辅助时间较长。 单元组成 板 布 板 布 板 操作注意点 尽量使工作时间和辅助时间接近; 降低滤液粘度 (2) 真空转鼓过滤机 1)切向流过滤,又称错流过滤 交叉过滤和十字流过滤,是一种维持恒压下高速过滤的技术。其操作特点是使悬浮液在过滤介质表面作切向流动,利用流动的剪切作用将过滤介质表面的固体(滤饼)移走。 2)双水相萃取 向水相中加入溶于水的某些高分子化合物(如葡聚糖、聚乙二醇等)后,形成密度不同的两相,轻相中富含某种高分子化合物,重相中富含盐类或另一种高分子化合物,从而达到分离和提纯某种高分子化合物的目的。 3)吸附法 向细胞碎片悬浮液中加入某种固体吸附剂,或者用细胞碎片悬浮液通过装有吸附剂的固定床,即可达到除去细胞碎片的目的。主要的问题是很难选择合适的吸附剂,以保证目的产物不被吸附而损失。 3. 其他固液分离方法 第三节 细胞破碎方法 破碎率:被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分数。 N0:原细胞数,N:破碎后残存的正常细胞。N0和N的可通过直接计数和间接计数法得到。 3.2 细胞破碎理论 1)、细胞破碎 A 压撞 B 剪切 Ca 渗透 Cb 冻胀 D 破壁破膜 超声波法 高压匀浆机 组织捣碎机 细菌磨 珠磨法 反复冻融法 渗透压冲击法 冷热变替法 有机溶媒法 自溶法 酶法 机械破碎法 物理破碎法 化学破碎法 细胞破碎法 3.3 细胞破碎方法 超声波破碎 超声波破碎原理:超声波作用下液体发生空穴化作用,产生极大的冲击波和剪切力,使细胞破碎。 超声空化:存在于液体中的微小气泡(空化核)在超声场的作用下振动、生长并不断聚集声场能量,当能量达到某个阈值时,空化气泡急剧崩溃闭合的过程。 优点:适合于多种细胞的破碎 缺点:A、影响因素多,如振幅、黏度、表面张力、液体体积和流速、探头材料和形状; B、超声产生超氧离子毒害作用; C、有效能量的利用率低; D、产热大,需控温; E、不易放大,仅应用于实验室规模的细胞破碎。 高压匀浆破碎原理:主要利用细胞悬液在高压作用下液相剪切力以及细胞与固定表面的撞击力而使之破碎。 特点:适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎,不宜用于团状或丝状菌的破碎;由于操作中温度会 升高,需对料液作冷却处理,保护目的产物活性。 适合于工业上的大规模应用 高压匀浆破碎   珠磨法破碎原理:利用在高速搅拌作用下,细胞和微球相互磨擦碰撞而破碎。 珠磨机可用于酵母和细菌,但对真菌菌丝和藻类更合适. 特点:适用范围较广;但有效能量利用率很低,设计操作时应充

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