用荧光显微镜结构及观察口腔上皮细胞的DNA.ppt

实验 荧光显微镜结构及口腔粘膜上皮细胞DNA的观察 实验目的 实验原理 仪器、材料与试剂 实验步骤 实验报告及思考题 实 验 目 的 了解荧光显微镜的基本构造和基本光路 了解荧光探针Hoechst33258或33342与细胞成分的结合特性和光谱特性 荧光显微镜 什么是荧光 ? 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。 即：物质吸收短波光，发射出的长波光。 一种光化荧光 荧光的种类 荧光的性质 落射荧光显微镜的构造 落射荧光显微镜各部件特性和作用 落射荧光显微镜原理 滤色镜的选择 实 验 原 理 荧光显微镜要求有特殊的光源提供足够强度和较短波长的激发光，诱发荧光物质发出较长波长的荧光。视野中所看到的像，主要是样品的荧光映像。荧光显微镜技术是在光学显微镜水平上对蛋白质和亚细胞组分进行定位的最常用的方法之一。非免疫荧光探针可用来直接标记许多特殊的亚细胞组分及生物大分子。这些探针大多数能被活细胞直接摄取并掺入和聚集在特定的细胞器中，因此我们就可以通过荧光显微镜对这些细胞器进行观察。 Hoechst33258是一种亲脂性物质，可跨膜进入活细胞，与DNA特异性结合，它主要结合在富含AT区域的DNA小沟部分。结合DNA后荧光大大增强，最大激发光波长约为350nm, 最大发射光波长约为461nm。可用于活细胞观察，不需要对细胞作固定及透化处理。 仪器、材料与试剂 仪器：荧光显微镜， 材料：口腔粘膜上皮细胞，载玻片，牙签 试剂：PBS(pH 7.4) Ho.33258 or H.33342（10μg/mL，溶于PBS) 实 验 步 骤 在1张载玻片上分别滴加一滴PBS溶液 用牙签刮取口腔上皮细胞，分别涂于载玻片上（牙签在液滴中搅匀） 在涂细胞处分别滴加10μg/mL的Hoechst.33342盖片——室温暗处孵育2-3分钟 用紫外光激发，观看细胞DNA荧光 注 意 事 项 盖片时防止产生气泡 滴加的染料不宜太多，否则背景太深，影响观察 注意避光，包括制片、荧光观察和探针保存 操作时防止污染皮肤和环境 * * 自发荧光 次生荧光 自发荧光：物质受光激发产生的固有荧光 次生荧光：物质借荧光色素受光激发产生的荧光 吸收光 保持固有的荧光特性 荧光波长＞激发波长（STOKES 法则） 荧光强度极小于激发光的强度 有不同程度的衰减 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率 吸收滤色镜 激发滤色镜 分色镜 汞灯 紫外线保护罩 孔径光栏（FS） 视场光栏（AS） 汞灯光源: 提供激发光(UV、B、G) 激发滤色镜: 波长选择 nm T% BAND PASS 汞 灯 激发滤色镜 分色镜 吸收滤色镜 物 镜 标 本 荧光素的特性 滤色镜的特性 激发 分色 吸收 —根据荧光素和滤色镜的特性选择滤色镜 荧光显微镜技术是利用一定波长的光（通常是波长短的紫外光和蓝紫光）照射被检样品，样品获得能量，产生能量跃迁，从基态到汽激发态，再从激发态回到原态，放出光和热能，产生的光为波长较长的光（相对于激发光波长），此可见光称为荧光。通过物镜、目镜的成像、放大，以供观察、检测和拍摄。 Sheet1 DAPI AMCA Hoechst 33258 FITC Acridine Orange Acridine Yellow CY3 TRITC Propidium Iodide 激发波长 发射波长 荧光素 372.00 456.00 350.00 450.00 365.00 465.00 490.00 520.00 490.00 590.00 470.00 550.00 552.00 565.00 541.00 572.00 530.00 615.00