《临床检验诊断学》20151008流式细胞术.pptVIP

单参数分析 Events：分析区域内的细胞数 %gate：门内细胞百分比 %total：检测细胞总数百分比 Mean：平均荧光强度 Geo mean：几何均数 CV：细胞荧光变异细胞 Median：荧光强度的中值 Peak Ch：峰值道数 M1 M2 多参数分析-二维散点图 前向角：激光检测区正向收集的小角度散射光。 与细胞的大小和细胞表面光滑度有关。 散射光强，细胞大；反之，细胞小。 侧向角：细胞通过测量90°方向的散射光 与细胞内部的精细结构和颗粒性质有关 散射光越强，细胞内部颗粒和细胞器越多 临床应用 淋巴细胞亚群测定 淋巴细胞功能分析 血液病免疫分型 肿瘤耐药基因筛查 免疫缺陷病 自身免疫病 器官移植 流式细胞仪与显微镜的区别 区别 流式细胞仪 显微镜 光源 激光 自然光、灯光 对象 细胞、生物粒子 细胞、组织等 承载工具 鞘液及流动室 载玻片 检测信号 光学信号 形态及染色 放大方式 PMT、放大电路 目镜×物镜、光学放大 统计 计算机，5000 人工，200 结果 多参数，综合分析 简单，单参数 科研设计 研究目的明确 研究方法清晰 研究指标明了 研究结果预测 科研论文写作 实验前 框架 实验中 填补数据，图表 试验后 讨论 为什么要做流式细胞 从基因水平进行验证？ 从蛋白水平进行验证？ 从细胞水平进行验证？ 功能研究？ 复习题 流式细胞仪的分析检测原理是什么？ 何谓荧光补偿？ FCM分析中有哪些数据显示方式，如何解读结果及其设门分析的意义？ 流式细胞术有哪些临床应用价值？ 流式细胞术 郑州大学第三附属医院 检验科 石 瑛 TELE-mail：syybr@126.com 临床检验诊断学研究生课程 参考书 实用流式细胞术 北京大学医学部出版社 刘艳荣 主编 临床流式细胞分析 上海科学技术出版社 王建中 主编 教学目的 掌握流式细胞术的基本工作原理 熟悉流式细胞术的临床及科研应用 了解流式细胞术的质量控制 流式细胞术定义 流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。 流式细胞术特点 流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。 流式细胞仪 是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高科技产品。 流式细胞仪常检测的细胞特性 细胞组成 细胞功能 大小 细胞表面/胞浆/核--特异性抗原 粒度 细胞活性 DNA, RNA含量 胞内细胞因子 蛋白质含量 激素结合位点 钙离子, PH值, 膜电位 酶活性 基本工作原理 流式细胞仪的结构组成 激光及光束形成系统 液流系统 光信号收集系统 电子系统 数据的存储、显示与分析系统 流式细胞术检测的几个重要过程 试验前 实验目的与方法的选择 实验流程的熟悉（说明书） 标本的收集与保存 荧光抗体的选择与染色（是否需要同型对照？空白对照？阴性对照？阳性对照？） 试验中 标本的处理 实验技巧的掌握（刺激培养？膜分子丢失？破膜？） 实验突发事件的处理能力（实验原理的掌握） 数据的处理与分析（百分数？荧光强度？凋亡？） 试验后 数据的处理与分析（***） 开始试验 1. 标本制备 外周血、采集物或骨髓：肝素或EDTA抗凝 组织细胞：单细胞悬液（机械法） 培养细胞： 体液：肝素抗凝 抗凝剂的选择 常用抗凝剂：EDTA、肝素、ACD EDTA：同时可进行白细胞计数与分类，标本 48h内是稳定的； 肝素：标本72h内是稳定的；试验前要进行形态 学观察 ACD：标本72h内是稳定的；试验前要进行形态 学观察 骨髓标本优先选择肝素抗凝 EDTA适用于白细胞免疫分型分析，可以防止成熟的髓系细胞贴壁造成细胞损失，且具有较强的抗血小板凝集的能力；缺点：fsc特征丢失较快 肝素常用于白细胞功能研究，其可以更好的维持细胞活性，放置更长时间，但是不适合血小板的相关检测 2. 荧光染色 免疫荧光染色 细胞表面抗原标记 细胞内或核内抗原标记 细