《临床检验诊断学》讲义2 基因诊断.pptVIP

基因诊断Gene Diagnosis 疾病的根本原因: 疾病的各种表型的改变 是基因的改变造成的。 基因诊断: 采用分子生物学的技术方法来分析受检者的某一特定基因的结构(DNA水平)或功能(RNA水平)是否异常，以此来对相应的疾病进行诊断。是病因的诊断。 检查基因的存在、缺陷或表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法和过程。 基因诊断的原理 1、基因诊断的原理： DNA诊断----检测相关基因的结构及其表达功能是否正常。 RNA诊断----对表达产物mRNA质和量表 达的分析。 第一节 基因诊断的技术方法 一、基因诊断中常用的分子生物学技术 ㈠ 核酸分子杂交 ㈡ PCR ㈢ SSCP（PCR-SSCP） ㈣ 限制酶酶谱分析 ㈤ DNA序列测定 ㈥ DNA芯片技术 核酸分子杂交 获得满意的高特异性杂交的关键是控制好杂交条件和杂交后冲洗条件。杂交双链的稳定程度主要由其Tm值（熔解温度）决定。影响杂交双链Tm值的因素包括以下几个方面： 1)杂交双链的碱基组成。GC含量越高，Tm越高。 2)杂交双链的长度。越长，Tm越高。 3)杂交双链的碱基错配程度。错配程度越低，Tm越高。 4)溶液中的离子强度。离子强度越高，Tm越高。 5)变性剂（如常用的甲酰胺）的影响。甲酰胺浓度越高，Tm越高。 在液相体系中，完全配对的核酸双链的Tm值可以下列公式估计： (二) 聚合酶链式反应（ PCR polymerase chain reaction) （三）、单链构象多态性(SSCP) 分析 PCR/单链构象多态性分析（SSCP） PCR产物变性后， 经聚丙烯酰胺凝胶电泳， 正常基因和变异基因的迁移位置不同， 可分析确定致病基因的存在。 四、限制酶酶谱分析 基因突变导致酶切位点的丢失或相对位置发生改变 以此酶消化待测DNA和野生型对照DNA，通过比较二者的酶切片段，的长度，数量上的差异就可判断待测DNA的突变情况。 ㈤ DNA序列测定 是进行基因突变检测的最直接、最准确的方法。不仅可确定突变的部位，而且可确定突变的性质。 分子克隆到T载体上，或直接对扩增产物进行测序。 二、基因诊断的基本方法 基因变异致病的类型： 内源基因的变异 基因结构的突变 点突变、插入、缺失、重排、异位、 基因扩增， 基因表达异常 mRNA剪接异常 外源基因的插入 ㈠基因突变的诊断 点突变的诊断 ①诊断已知的点突变 （PCR/ASO） ASO allele specific oligonucleotide 等位基因特异性寡核苷酸探针 突变碱基置探针中央 控制杂交条件 结果分析： ②诊断未知的突变 PCR/SSCP/测序 DNA芯片技术（大规模未知突变的筛查） N 4×n 1.28平方cm 16000个寡核苷酸 2 .大片段丢失或插入的诊断 外侧确定有无缺失及缺失片断的相对大小 内侧确定缺失部位. ㈡多态性连锁分析 DNA多态性——在同种生物不同个体的基因组中，常存在一些不影响基因功能的DNA顺序变异，称为DNA多态性（polymorphism） DNA多态性标记 限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP) 短串联重复序列（short tandom repeat, STR） 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP） 限制性片段长度多态性（RFLP） DNA→酶切→Southern杂交分析 DNA→PCR →酶切→电泳分析 由串联重复顺序导致的长度多态性 STR含有较高的信息量且容易检测 STR由2~6个核苷酸串联重复组成，微卫星DNA ㈢基因表达异常的诊断 mRNA的相对定量分析 斑点杂交 RT—PCR mRNA的绝对定量分析 RT—PCR/竞争性PCR(50bp标准cDNA 已知浓度) mRNA长度分析 Northern杂交/ RT—PCR产物电泳 ㈣ 外源DNA检测 核酸分子杂交 PCR技术 许多病原体的基因结构已被阐明，设计基因特异性探针，或合成特异的寡核苷酸引物，可直接从临床标本中检测病原体基因组核酸(DNA或RNA)的存在，即可早期、快速、敏感、特异地确定病原体的存在。 第二节 基因诊断的应用 1、遗传疾病 2、感染性疾病 （1）病毒性感染 （2）细菌性感染 （3）寄生虫 （4）其他 3、恶性肿瘤 4、法医学中的应用 （1）D