使用交联剂DM消除免疫沉淀非特异性条带.pdf

第 45卷第 1期第 27页 华 中科技大学学报 (医学版) Vo1．45 NO．1 P．27 2016年 2月 ActaM edUnivSciTechnolHuazhong Feb． 2016 使用交联剂 DMP消除免疫沉淀非特异性条带* 张 敏 ， 刘裕禄。， 张 春。， 熊 敏 ， 刘建社 ， 姜华军。△ 华 中科技大学同济医学院附属荆州医院肾内科 ，荆州 434020 华 中科技大学同济医学院附属协和医院肾内科 ，武汉 430022 摘要 ：目的 消除免疫沉淀技术 中免疫 印迹检测到的非特异性条带 ，排除非特异性条带对研究蛋白质分子相互作用 及磷酸化的干扰 。方法 检测蛋 白交联剂庚二亚氨酸二 甲酯 (DMP)交联抗体和载体基质 的稳定性及交联效果 ；积极寻 找和优化抗原析出条件 ，分离出免疫沉淀复合物中抗原成分 ；检测析出抗原特异性条带及磷酸化水平 。结果 DMP有 效地将抗体共价结合于载体基质 ，具有较好 的稳定性和交联效果，其免疫沉淀 中未检测到非特异性蛋 白条带；与 Lae— mmli缓冲液相 比，甘氨酸可有效地一次性析 出免疫沉淀中大部分抗原；经 pH值调整后 ，析 出抗原的浓度及磷酸化水平 无 明显变化。结论 交联剂 DMP能有效地消除传统免疫沉淀技术 中检测到的非特异性蛋 白条带，且能应用于蛋 白质 磷酸化 的检测 。 关键词 ：免疫沉淀 ； 蛋 白质相互作用 ； 蛋 白质磷酸化 中图分类号 ：R392 DOI：10．3870／j．issn．1672—0741．2016．O1．006 RemovalofNonspecificBandsinImmunoprecipitationM easurement byUsingDMP，aCross—linker ZhangM in ，LiuYulu ，Zhang Chun etal DepartmentofNephrology，JingzhouHospital，TongjiMedicalCollege，Huazhong UniversityofScienceandTechnology，Jingzhou434020，China 。DepartmentofNephrology，UnionHospital，TongjiMedicalCollege，Huazhong UniversityofScienceandTechnology，Wuhan430022，China Abstract Objective Toeliminatetheinterferenceofnonspecificbandsonthedetectionofproteininteractionandphos— phorylationbyremoving thenonspecificbandsin proteinspurifiedbyimmunoprecipitationtechnique．Methods Theprotein cross—linkerdimethylpimelimidate(DMP)wasusedtocross—linktheantibodyandproteinmatrix．Thestabilityandtheeffective— nessofDM P incross—linkingweredetectedseparately．Theconditionsfortheelutionofantigensfrom immunoprecipitatedcom— poundswereoptimized．Specificbandsandph0sphory1ated levelsoftargetantigensweremeasured byW esternblot．Results Theantibodyandproteinmatrixwerecross—linkedcovalentlyb