1676 生物单分子研究存在的关键问题空间分辨率低对单个生物分子的 .ppt

AFM研究单个多聚糖链的弹性 Rief M, et al., Science 275(1997)1295 AFM研究单个视紫红质去折叠途径 Oesterhelt F. et al., Science 288(2000)143 AFM研究单个DNA分子解链和复链过程 Albrecht C., et al., Science 301(2003)367 Krauthauer R., Nano Lett., 3(2003)493 结合荧光共振能量传递技术研究单个生物分子行为 Weiss S. Science, 283(1999)1676 生物单分子研究存在的关键问题 空间分辨率低 对单个生物分子的 操控不成熟 空间分辨率低 100 ?m 血红细胞 核小体与DNA DNA片断与RNA聚合酶分子的转录识别 染色体 /nanotheatre/nano_view.asp?nano=1Submit=GO 我们的工作和设想 （1） 高分辨AFM针尖 * * * * 纳米级生物分子测量的新方法和新技术 肖忠党 国家教育部分子与生物分子电子学重点实验室 东南大学，吴健雄实验室 东南大学，生物科学与医学工程系 杭州 2003.9.13 主 要 内 容 ? 生物分子测量的常规手段 ? 生物分子测量技术的发展 ? 生物单分子测量的新技术 ? 存在的问题及展望 X射线衍射 中子衍射法 分子晶体 核磁共振法 园二色谱法 荧光光谱法 喇曼光谱法 小角散射 溶液状态 生物分子 生物分子空间 结构测量 ? 生物分子测量的常规手段 生物分子空间 结构测量 各种显微镜技术 荧光显微镜 激光共聚焦 显微镜 电子显微镜 扫描探针 显微镜 近场光学 显微镜 生物分子 动力学测量 核磁共振法 园二色谱法 荧光光谱法 喇曼光谱法 小角散射 快速混合停流谱 （Mixing Stopped-flow Spectroscopy） 时间分辨波谱 等等 慢反应过程 （分钟级） 快反应过程 （毫秒级） （如蛋白质折叠） 常规生物分子测量 技术的局限性 有限的时间分辨率 分子测量结果为 很多分子的平均 有限的空间分辨 ? 生物分子测量技术的发展 1、第三代同步辐射波谱技术 光束线出口在CCD探测器上 成像的单色光斑 蛋白晶体衍射图样 同步辐射光具有高亮度、高度单色、高度准直，高稳定性，以及 宽波谱等优点，同步辐射波谱具有更高的灵敏度和良好的空间分辨率 /5kydt.html 中科大国家同步辐射实验室 第二代同步辐射 北京高能所同步辐射装置 第一代同步辐射 /5kydt.html 2、超快混合连续流动谱技术 Comparison of experimental methods for detection of fast protein folding reactions and their accessible time-scales Bieri O., Kiefhaber T., Biol. Chem. 380(1999)923 温度跃变只适用于肽类和极少数在合 适温区发生冷变形的蛋白质分子 光化学触发需要给蛋白质分子 结合上特殊的光敏基团 NMR迟豫以及压力跃变方法只 适合分子折叠的转变态 为什么选择超快混合 连续流谱技术？ 1）超快混合技术是一种通用的手段 2）应用超快混合连续流谱技术可以在非常接近蛋白质分子 天然状态的情形下研究其折叠过程 Bieri O., Kiefhaber T., Biol.Chem. 380(1999)923 连续流动超快混合反应光谱仪结果图 Figure 3 Dead time calibration of the mixer. (a) Plot of the fluorescence quenching reaction of NATA by NBS at different final NBS concentration. [NATA]final=20 ?m. (b) The solid line is a fit to the plot of the pseudo-first-order rate constants as a function of NBS concentration. This yields the second-order rate constants for the NATA-NBS reaction of 6.8X10-5 M-1S-1. 超快混合连续流谱技术研究免疫球蛋白Im7的折叠中间体 Im7是由53个氨基酸组成的免疫球蛋白分子，具有四个?螺旋结构。已经证明其折叠只有一个中间态，但是其折叠途径可能有两个模型 。 Figure 4. Fluorescence changes during