- 1、本文档共3页,可阅读全部内容。
- 2、有哪些信誉好的足球投注网站(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
查看更多
人溶菌酶中的S-S键合部位分析
人溶菌酶中的S-S 键合部位分析
摘要:本文综合使用肽指纹图谱分析和质量分析的方法,在多种条件下使用胰蛋白酶等蛋白质
分解酶对人溶菌酶(Lysozyme )进行酶切,将生成肽片段的分子量与理论值进行比较,从而对
S-S 键合部位进行解析。
关键词: 人溶菌酶 Lysozyme MALDI-TOF S-S 键合部位分析
当目标抗体的基因序列中存在半胱氨酸残基时,需在可能的范围内确定所有的巯基或二硫
键合的数目和位置,检测方法为肽指纹图谱分析(还原条件及非还原条件下)、质量分析或其他
适宜的分析方法。
本文介绍了综合采用肽指纹图谱分析和质量分析的方法,分析人Lysozyme 的方法。
1. 实验部分
1.1 仪器
岛津AXIMA MALDI-TOF(AXIMA Confidence 或AXIMA Performance 系列)
岛津LC-20A Prominence 系统
1.2 实验步骤
1. 使用无细胞蛋白质合成试剂组件(Transdirect insect cell), 在试管内合成人Lysozyme ;
2. 使用亲和色谱柱(Strep-Tactin super flow, QIAGEN 公司,德国)进行纯化;
3. 使用8 M 尿素进行变性;
4. 进行3 种前处理:未处理(依然保持S-S 键合),S-烷基化处理(如果存在游离的SH 基,
则烷基化SH 基),还原烷基化(还原S-S 基,然后烷基化SH 基),然后进行胰蛋白酶酶切;
5. 使用ZipChip (Millipore 公司,美国)进行脱盐纯化后,使用AXIMA MALDI-TOF 检测。
2. 结果与讨论
在试管内合成的人Lysozyme 的氨基酸序列以及预测的S-S 键合部位(以实线标记)如图 1
所示。胰蛋白酶酶切肽片段(仅为S-S 键合相关部分)的理论值及MS 测定的结果见下表1。
图1 合成的人Lysozyme 的氨基酸序列及预测的S-S键合部位
51
表1 预测肽片段(仅为S-S键合部位)的理论值与测定值
肽片断B 经过还原烷基化处理,m/z 3239.22 的离子消失,可知肽3 和肽4 在分子内形成了
S-S 键合;根据同样的方法,在肽片断C 的分子内也可确认有S-S 键合。部分的蛋白酶酶切肽
片断的质谱图见图2.
肽片断A 也通过比较同样的还原烷基化处理/未处理的质谱图,可知肽1 和肽2 在分子内形
成了S-S 键合,但只依据图2 的结果还无法确认半胱氨酸残基的组合。为确认这个组合,需要
使用LC 对肽片断A 进行分离/纯化后,以其他的蛋白质分解酶(嗜热菌蛋白酶)进行酶切后确定
生成片断的质量,以此确认肽1 的分子内也有S-S 键合部位( 图3) 。
图2 回收的部分肽片段质谱图(m/z 3200~m/z 3900)
52
图3 肽片断A(m/z 3636.36) 的嗜热菌蛋白酶酶切结果的质谱图
3. 结论
本文综合使用肽指纹图谱分析和质量分析的方法,在多种条件下使用胰蛋白酶等蛋白质分
解酶对人 Lysozyme 进行酶切,将生成肽片段的分子量与理论值进行比较,从而对 S-S 键合部
位进行解析。
53
文档评论(0)