人溶菌酶中的S-S键合部位分析.PDF

人溶菌酶中的S-S 键合部位分析 摘要：本文综合使用肽指纹图谱分析和质量分析的方法，在多种条件下使用胰蛋白酶等蛋白质 分解酶对人溶菌酶（Lysozyme ）进行酶切，将生成肽片段的分子量与理论值进行比较，从而对 S-S 键合部位进行解析。 关键词： 人溶菌酶 Lysozyme MALDI-TOF S-S 键合部位分析 当目标抗体的基因序列中存在半胱氨酸残基时，需在可能的范围内确定所有的巯基或二硫 键合的数目和位置，检测方法为肽指纹图谱分析（还原条件及非还原条件下）、质量分析或其他 适宜的分析方法。 本文介绍了综合采用肽指纹图谱分析和质量分析的方法，分析人Lysozyme 的方法。 1. 实验部分 1.1 仪器 岛津AXIMA MALDI-TOF(AXIMA Confidence 或AXIMA Performance 系列) 岛津LC-20A Prominence 系统 1.2 实验步骤 1. 使用无细胞蛋白质合成试剂组件(Transdirect insect cell), 在试管内合成人Lysozyme ； 2. 使用亲和色谱柱(Strep-Tactin super flow, QIAGEN 公司，德国)进行纯化； 3. 使用8 M 尿素进行变性； 4. 进行3 种前处理：未处理（依然保持S-S 键合），S-烷基化处理（如果存在游离的SH 基， 则烷基化SH 基），还原烷基化（还原S-S 基，然后烷基化SH 基），然后进行胰蛋白酶酶切； 5. 使用ZipChip (Millipore 公司，美国)进行脱盐纯化后，使用AXIMA MALDI-TOF 检测。 2. 结果与讨论 在试管内合成的人Lysozyme 的氨基酸序列以及预测的S-S 键合部位（以实线标记）如图 1 所示。胰蛋白酶酶切肽片段（仅为S-S 键合相关部分）的理论值及MS 测定的结果见下表1。 图1 合成的人Lysozyme 的氨基酸序列及预测的S-S键合部位 51 表1 预测肽片段（仅为S-S键合部位）的理论值与测定值 肽片断B 经过还原烷基化处理，m/z 3239.22 的离子消失，可知肽3 和肽4 在分子内形成了 S-S 键合；根据同样的方法，在肽片断C 的分子内也可确认有S-S 键合。部分的蛋白酶酶切肽 片断的质谱图见图2. 肽片断A 也通过比较同样的还原烷基化处理/未处理的质谱图，可知肽1 和肽2 在分子内形 成了S-S 键合，但只依据图2 的结果还无法确认半胱氨酸残基的组合。为确认这个组合，需要 使用LC 对肽片断A 进行分离/纯化后，以其他的蛋白质分解酶(嗜热菌蛋白酶)进行酶切后确定 生成片断的质量，以此确认肽1 的分子内也有S-S 键合部位( 图3) 。 图2 回收的部分肽片段质谱图(m/z 3200~m/z 3900) 52 图3 肽片断A(m/z 3636.36) 的嗜热菌蛋白酶酶切结果的质谱图 3. 结论 本文综合使用肽指纹图谱分析和质量分析的方法，在多种条件下使用胰蛋白酶等蛋白质分 解酶对人 Lysozyme 进行酶切，将生成肽片段的分子量与理论值进行比较，从而对 S-S 键合部 位进行解析。 53