120L反应器微载体培养ST细胞生产猪瘟病毒技术介绍摘要.PDF

120L 反应器微载体培养ST 细胞生产猪瘟病毒技术介绍 ——中国系（C 系）猪瘟兔化弱毒 默克密理博北京清大天一科技有限公司 一、 技术背景 利用ST 传代细胞系生产的猪瘟病毒活疫苗，已经在国内生产、销售，并已 形成猪瘟活疫苗（传代细胞源）质量标准（暂行）。 目前，该生产工艺是采用传统的转瓶培养ST 细胞工艺，即种子脾毒或细胞 毒接种已形成单层的转瓶ST 细胞，每4－5 天收获一次毒液，基本等同于当前转 瓶培养牛睾丸原代细胞生产猪瘟病毒工艺；因不同转瓶均是独立的细胞培养单 元，每瓶的细胞质量、病毒产量和滴度都不同，导致疫苗批间差大，而且操作劳 动强度大，隐性污染引起高内毒素等缺点。 反应器微载体培养 ST 细胞的猪瘟病毒工艺，微载体提供了更大的细胞贴壁 表面积，不仅能提高ST 细胞密度，提高病毒滴度，而且反应器能自动监控细胞 生长或病毒繁殖时的最适生化条件，每批反应器生产上清的病毒滴度均一，疫苗 批间小、质量稳定。 MMBS 研发了适用于反应器微载体培养 ST 细胞的个性化细胞培养基、120L 反应器微载体培养 ST 细胞技术、120L 反应器微载体培养 ST 细胞生产猪瘟病毒 等技术，为反应器微载体生产猪瘟活疫苗技术的产业化奠定了扎实的基础。 二、 工艺技术 反应器微载体培养ST 细胞生产猪瘟病毒工艺：利用ST 细胞专用培养基，血 清（BVDV 抗体阴性）浓度可降低至5％，从液氮中复苏ST 细胞，方瓶、转瓶培 养扩增种子细胞，直接消化15L 转瓶的ST 细胞，将种子 ST 细胞接种到120L反 应器中，进行微载体悬浮培养，待ST 细胞生长至选择合适密度，接种猪瘟种毒， 不断地收获病毒上清。 图1 和图2 分别表示了反应器微载体培养ST 细胞工艺过程的接种细胞24hr 后以及接种病毒前的照片。反应器中的微载体浓度为3g/L 时，细胞密度可以达 6 到1×10 cells/ml 以上，收获的病毒上清大于200000 家兔感染量/ml。图3 和 图4 是接种一定量猪瘟病毒后，连续维持25 天的ST 细胞照片：多次收毒后，维 持25 天的微载体上ST 细胞仍贴壁良好，形态饱满。 1 图1：反应器微载体上ST 细胞（接种24hr 后）图2：反应器的微载体长满ST 细胞（接毒前） 图3：接毒后维持培养25 天的ST 细胞 (100X ) 图4：接毒后维持培养25 天的ST 细胞(200X ) 三、 工艺流程 无菌、合格的 复苏ST 细胞 新鲜猪瘟脾毒 方瓶培养ST 细胞 接种ST 细胞 15L 转瓶培养ST 细胞 120L反应器培养ST 细胞 种子细胞猪瘟病毒液 毒 120L反应器生产猪瘟病毒 收获猪瘟病毒上清 配苗 2 四、 生产能力评估 一批疫苗生产能力： 120L反应器的培养体积在75L 左右，运行近一个月， 收获 50 万mL 的病毒液（约20 万家兔感染量/ml ），按现有规程可制备1300 万头 份苗：50÷(7500÷200000)=1300 万(头份)，即年产量 1300×11=14300 万（头 份） 五、 项目验证 MMBS在受让方现场进行2个批次的120L反应器培养ST细胞生产猪瘟病毒工 作，受让方协助MMBS进行必要准备工作（如清洗、准备、灭菌等），但不参与反 应器的细胞和病毒培养工作，此阶段MMBS不向受让方提供工艺参数和技术资料。 每进行1批次的12