基于PCR的染色体步查技术.ppt

* * 基于PCR的染色体步查技术 染色体步查(Chromosome walking) 是指由生物基因组或基因组文库中的已知序列出发,逐步探知其旁邻的未知序列或与已知序列呈线性关系的目的序列的核苷酸组成的方法和过程。 经典的染色体步查方法比较烦琐，适合于长距离步行，而基于PCR的染色体步行技术相对而言则比较简便，适合于短距离步行。 基于PCR的染色体步查技术 典型的PCR反应需要2个分别位于目的序列两端的引物，而在染色体步行时目的序列只有一端是已知的，因此利用PCR技术进行染色体步行的关键在于提供PCR需要的另一个引物。 利用载体或接头的PCR技术 利用引物错配的染色体步查技术 利用随机引物的染色体步查技术(TAIL-PCR) 利用载体或接头的PCR技术 这类方法的第一步通常都是酶切基因组DNA，连接载体或接头,以提供PCR需要的另一端引物. 利用载体的PCR 利用接头的PCR 寡聚盒介导的PCR 环状PCR I-PCR(Inverse PCR) P-PCR(Panhandle PCR) 利用载体的PCR 1989年，Shyamala等利用单特异引物PCR(single specific primer PCR, SSP—PCR)以小鼠伤寒杆菌组氨酸转运操纵子为起点进行连续步查。用PstI+ AraIM酶切基因组DNA，PstI+XmaI酶切载体DNA,然后连接基因组片段和载体片段，用根据基因组DNA序列设计的特异引物和载体的通用引物进行扩增. 由于非特异片段没有特异引物的结合位点,即使有载体连接到非特异片段，它也不能得到大量扩增，而使特异片段得到有效扩增。 在这种方法中，如果用合适的接头代替载体效果也会一样。这种方法原理简单，实验设计简便，但操作较为繁琐，特异性较低，即使用嵌套引物扩增也往往会造成非特异性扩增，产物仍需杂交进一步确定。之后出现了一些方法利用不同的技术增强PCR的特异性。 利用接头的PCR 1995年，Siebert结合Vectorette PCR和Suppression PCR设计改进了利用接头的PCR 。 (1)选择合适的酶切位点酶切总基因组； (2)用连接反应将人工合成的接头连接在酶切片断两端； (3)S-PCR(suppression PCR) 所连接的双链接头是反向重复序列。 A,如果PCR产物的两末端是双链接头序列，由于反向末端重复序列的存在，每条DNA链的末端就要形成panhandle结构，故而阻止PCR的指数增加。 B,如果PCR产物一端是特异引物序列，另一端是接头序列时形不成panhandle结构，PCR扩增正常进行。 (4)vectorette’ 接头由一条长链和一条短链组成; 短链3‘端用-NH2封闭,使接头中的短链不会在PCR开始时自身延长; 在第一个延伸反应中,接头引物无模板配对,只有特异引物起作用延伸出一条单链; 在第二个延伸反应中,接头引物才能以第一个反应中延伸出的单链为模板开始扩增. NH2 NH2 Gel electrophoresis analysis of the representative PCR products derived from L. borgpetersenii genomic DNA. The PCR walking templates were prepared from EcoRV-digested DNA or from PvuII digested L. borgpetersenii genomic DNA. Lane 1, DNA marker; lane 2, primary PCR products from primers AP1 and P12; lane 3, secondary PCR products from primers AP2 and P13. The arrow indicates the PCR fragment that was cloned for sequencing. 2000年，Mogens Kilstrup 进一步改进此方法. 不要求接头的两条寡核苷酸链一长一短，而使接头两端均为-OH,不含磷酸基团。 在第一个变性反应时，和接头引物配对的接头寡核苷酸链会游离出来； 在第二个延伸反应中,接头引物才能以第一个反应中延伸出的单链为模板开始扩增. A,B,C EcoRI酶切基因组的扩增产物 D,E,F HindIII酶切基因组的扩增产物 A,D 只加接头引物 B,C,E,F 不同的特异引物和接头引物 寡聚盒介导的PCR 寡聚盒介导PCR是利用双链接头进行染色体步行的