基因工程大肠杆菌表达系统.ppt

前言 基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。 基因工程主要目标之一是生产常规方法难以生产的大量蛋白质产物—即实现基因的高效表达。 基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。 最佳的基因表达体系： ⑴目的基因的表达产量高; ⑵表达产物稳定; ⑶生物活性高; ⑷表达产物容易分离纯化。 宿主细胞的选择 适合目的基因表达的宿主细胞的要求: 1、容易获得较高浓度的细胞； 2、能利用易得廉价原料； 3、不致病、不产生内毒素； 4、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态； 5、容易进行代谢调控； 6、容易进行DNA重组技术操作； 7、产物的产量、产率高， 8、产物容易提取纯化。 宿主细胞分为两大类： 1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、 链霉菌等； 2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数 （2）结构决定因子与蛋白质的稳定性 ? 与蛋白质稳定性相关的确切的分子结构特征？ 不清楚 ? 但已经明确了若干种影响蛋白质稳定性的结构决定因子。 其中最重要的：N-端氨基酸性质。 N-端氨基酸性质 “N-端法则”: 在生物体内蛋白质新陈代谢的稳定性，主要取决于N-端氨基酸的性质。 在大肠杆菌细胞质内，若蛋白质N-端为Arg、Lys、Leu、Phe、Tyr 和Trp等残基，则其稳定性较差；而同样条件下，若N-端为除了前述6种氨基酸之外的其它任何一种氨基酸残基时，其稳定性则大大提高。 § 重组操作时， N-端增加一个增加稳定性的氨基酸 （3）表达天然的蛋白质 以形成融合蛋白的形式在大肠杆菌细胞中表达外源真核基因具有许多方面的优越性。例如，产物比较稳定，可以免受胞内蛋白酶的降解作用，可以获得较高的产率。 Tacon等人在80年代初期，使用大肠杆菌的trp启动子和与之相连的SD序列，构建了两种有利于表达天然蛋白质的质粒载体。pWT551和pWT571 （4）分子伴侣（molecular chaperone）稳定作用 分子伴侣：指一类多功能蛋白质，它能够通过阻止诸如聚合作用这样的副反应，来促使其它蛋白质按正确的方式折叠，而其本身却不是最终形成的功能蛋白质的组成成分。 通过分子伴侣与克隆的外源基因在大肠杆菌寄主细胞中共表达是增强目标蛋白的稳定性、实现高水平表达的有效方法。 （5）大肠杆菌突变体菌株与蛋白质的稳定性 通过产生融合蛋白途径增加外源多肽稳定性的方法，已有许多文献报道，但此法的一个突出缺点是所产生的融合蛋白并不一定都能够在体外将天然蛋白质完整无损地切割下来。 一种相当有效的变通办法是，使用胞内蛋白酶含量很低的大肠杆菌突变株，作为表达外源蛋白质的寄主细菌。其中用得最多的是缺失lon蛋白酶的大肠杆菌突变株。 五、影响克隆基因在大肠杆菌中表达效率的因素 启动子的强度、DNA转录起始序列、密码子的选择、mRNA分子的二级结构、转录的终止、质粒的拷贝数以及质粒的稳定性和寄主细胞生理特征等都会不同程度地影响克隆基因的表达效率。 1、启动子对克隆基因表达效率的影响 (1) 启动子结构对表达效率的影响 大肠杆菌启动子的序列结构具有两个保守序列，即-35区（5’-TTGACA）和-10区（5’-TATAAT），后者又叫Pribnow盒。 应用半乳糖激酶系统检测结果表明：启动子序列与上述保守序列之间相似程度越高，其表达能力也就越强，两者呈正比关系。 此外，两个保守序列之间的距离也影响克隆基因的表达效率，这段间隔距离越接近于17个碱基，启动子的活性就越强。 （2）启动子与克隆基因的间隔距离对表达效率的影响 Roberts等用?plac5.1 DNA的含有lac启动子和SD序列与?cro基因表达序列构建了不同间隔距离的重组质粒载体。从中挑选了9种不同的重组质粒载体，分别转化大肠杆菌细胞，然后测定各种克隆所产生的cro蛋白质含量，同时也对每种质粒中的连接lac-cro基因的结合区序列进行测定。 …ACAATTTCACAGGAAACAGGATCCGGGACTATTTTACCTATGGCGGTGATAATGGTTGCATGTACTAAGGAGGTTGTATG …TGTTAAAGTGTCCTTTGTCCTAGGCCCTGATAAAATGGATACCGCCACTATTACCAACGTACATGATTCCTCCAACATAC BamHI 从lac启动子开始转录 Cro转译起始密码 SDlac pTR213 pTR199 p