基因工程第三章2：操作技术.ppt

Chapter three Techniques of genetic engineering 六. Different ramificate(衍生的）methods of PCR 1、热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。 原因：尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。因此，PCR反应体系配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。 ???? 对策： 限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。这种方法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。 热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。 包括延缓加入Taq DNA聚合酶; 使用蜡防护层将一种基本成分，如镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起; 聚合酶的活性需经过 95 ℃ 10mins 的高温造成化学修饰基团的脱落，然后才有聚合的活性. 2、Touch-down PCR 7、多重PCR 多重PCR（multiplex polymerase chain reaction， MPCR）也称为复合PCR，是在常规PCR的基础之上进行改进从而发展起来的一种新型的PCR扩增技术，多重PCR技术的基本原理与常规的PCR技术相同。 多重PCR技术主要有两种形式：一、将多条引物和多个模板DNA混合在同一个反应体系中分别特异扩增不同的目的条带，常用于突变缺失检测、多态分析等；二、将多条引物和单一的模板DNA混合在同一反应体系中扩增同一模板的不同片段，常用于对超长片段的扩增。 8.反向PCR： 常规PCR只能扩增两个引物之间的DNA区段，但有时我们想知道基因之外的两侧未知DNA序列，这样就出现了反向PCR。 反向PCR首先将DNA用限制性内切酶切割，切割要保持已知序列两端有未知序列，进行环化，然后用引物进行扩增。产物是已知序列以外的序列。 9.PCR－RFLP(restriction fragment length polymorphism) 是一种借助于限制性内切酶对PCR扩增片断进行酶切分析的方法。用于鉴定分类。 基因有保守区，有可变区，我们可以依据保守区设计共同的引物，然后用酶进行酶切分析，不同的物种的酶切分析图不同，这种图谱也叫指纹图谱。 10. PCR定点诱变： ＰＣＲ法的原理也是利用人工合成带突变位点的诱变引物，通过ＰＣＲ扩增而获得定点突变的基因或ＤＮＡ片段。PCR定点诱变法可分为重组PCR定点诱变法和大引物诱变法两种。 四、脉冲电场凝胶电泳（PFGE） Chapter three Touch-down PCR又称降落PCR。即选定一个温度范围，如65—50 ℃ ，每降1-2 ℃进行1-2个循环，然后在50度下进行15个循环。 Touch-down的原理：随着退火温度的降低，特异性逐步降低，但特异性条带在温度较高时已经扩增出来，其浓度远远超过非特异性条带，随着退火温度的降低，特异性条带优先被扩增。 选择初始复性温度的原则：起始复性温度应该比引物的Tm值高出5-10度，然后每个循环递减1-2度 Touch-down PCR的应用范围 low copy of targeted DNA; high degree degeneracy (or less specific) of the set of primers; RT-PCR using oligo-dT. 3、巢氏PCR（Nested PCR） 巢氏PCR需要两到三对引物，一般采用第一套引物扩增15-30个循环，再用扩增DNA片段内设定的第二套引物扩增15-30个循环，这样可使待扩增序列得到高效扩增，而次级序列却很少扩增。套式引物PCR减少了引物非特异性退火，从而增加了特异性扩增，提高了扩增效率。 若将巢氏PCR的内外引物稍加改变，延长外引物长度（25-30bp），同时缩短内引物长度（15-17bp），使外引物先在高退火温度下复性，做双温扩增，使内引物在外引物扩增的基础上，在低退火温度复性，直到扩增完成，这样就可以使两套引物一次同时加入。 4、原位PCR 原位PCR就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术. 原位PCR是Hasse等于1990年建立的，实验用的标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细