基因表达与蛋白质纯.ppt

基因表达与蛋白质纯化技术探讨 报告人 曹雪美 主 要 内 容 基因表达体系及优劣势 大肠杆菌中表达蛋白质及纯化方法 可能碰到的问题 什么是基因表达呢？ 基因表达(gene expression)是指储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过程。典型的基因表达是基因经过转录、翻译，产生有生物活性的蛋白质的过程。 基因表达体系 1.? 原核体系 2. 真核体系 大肠杆菌 (Escherichia coli) E . coli 是重要的原核表达体系。在重组基因转化入E.coli 菌株以后，通过温度、诱导剂用量以及诱导时间的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS以检测表达蛋白质 大肠杆菌 (Escherichia coli) 遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高； 基本不分泌蛋白，易形成包含体(无正确折叠的立体结构)，无加糖等修饰 枯草杆菌 (Bacillus subtilis) 分泌蛋白质能力强，一般有天然立体结构； 无加糖修饰功能，培养液中蛋白酶活性高，重组蛋白易受蛋白酶的水解； 质粒不稳定，尚无商品化的表达载体 其 他 乳酸菌 (Lactic acid bacteria) 沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) 苏云金杆菌 (Bacillus thuringiensis) 真核表达 真核细胞表达体系 酵母细胞 昆虫细胞 哺乳动物细胞/组织 植物细胞/组织 酵母细胞 可生产分泌型蛋白；有天然立体结构，有加糖修饰功能；可进行染色体整合型基因表达; 糖链与哺乳动物加工的不一致，培养上清多糖浓度高; 商品化表达体系： 酿酒酵母（Saccharomyce cerevisiae）; 毕氏酵母 (Pichia pastoris); 裂殖酵母（Schizosaccharomyce pombe） 昆虫细胞 可以病毒感染的型式在成虫中生产，也可在体外培养细胞中生产蛋白; 适合分泌型和膜蛋白的表达，有加糖修饰； 糖链有所区别，表达量有限； 作为药物宿主细胞未被FDA认可 CHO细胞 可进行分泌表达，有天然立体结构，加糖方式与人体蛋白质完全一致； 表达量不够高，培养成本较高 植物组织 植物可大面积种植，可以廉价大规模生产； 转基因植物制作费时，表达的组织特异性较难控制； 表达量较难提高，分离纯化不方便 动物乳腺组织 分泌生产有天然立体结构和活性的蛋白质至乳汁，产量高，分离纯化方便，特别适合药用蛋白的生产； 转基因动物制作花费巨大，实验周期长 原核表达与真核表达的区别 1、载体的区别 整合机制 2、表达产物的区别 蛋白修饰的程度 体系选择 研究基因功能: 大肠杆菌, 裂殖酵母,昆虫细胞, CHO细胞 多肽药物生产: 大肠杆菌, 毕氏酵母, CHO细胞, 乳腺组织 疫苗: 大肠杆菌, 酵母, 大多数沿用细胞培养产物进行灭毒 单抗生产: 杂交瘤细胞 工业酶生产: 各种微生物 在大肠杆菌中表达外源基因 原核表达一般程序 原核表达操作步骤 （三）获得含重组表达质粒的表达菌种 （四）诱 导 表 达 重组蛋白的表达形式 SDSSDSSDSSDSSDS大肠杆菌表达载体分类 常用表达载体 各种融合蛋白表达载体 各种用于抗体识别的标记 融合蛋白的专一性切割 特殊的表达用菌株 重要的原核表达质粒提供商 让表达产物可溶化 让蛋白质分泌到间质去 包含体来源蛋白质的复性 原核表达优化策略—如何避免包涵体表达 延长表达时间（过夜），低温培养（25－30） 诱导条件的优化 某些氨基酸的取代 共表达分子伴侣，硫氧还原蛋白的融合表达或与目标蛋白的共表达 蛋白毒性，稳定性分析，更换宿主菌(利用硫氧还蛋白还原酶缺陷菌株作为宿主菌)。 ■ 培养基中可加葡萄糖，通常用2%的浓度。 ■ 在培养过程中，要保持细菌摇瓶有良好的通气条件，充足的氧流量可以减少包涵体的形成 重组蛋白的纯化方法 1.?层析技术 2. 电泳技术 Ni-NTA亲和层析 His标签蛋白的纯化流程 经常碰到的问题 目前我实验过程中碰到的问题 未检测到