基因表达检测RT-PCR.ppt

操作步骤（一） RNA Preparation Prepare the plant total RNA by TRIzol Reagent. Dilute the Total RNA to the final concentration of 1 ?g / ?l by DU640. . Combine the following in a 0.5 ml sterile eppendorf tube: Total RNA 3?l (2-5?g) RNase-free DNase ? １?l (１u / ?l) 10× DNase ? buffer 1 ?l add DEPC-treated ddH2O 5 ?l Incubate at 37℃ for 15 min, then 70℃ for 10 min. 操作步骤（二）Reverse Transcriptase Reaction Add 1 ?l 500 ?g / ml oligo (dT) 15 primer, mix the contents of the tube by gently vortexing and collect the reaction by brief centrifugation. Heat the mixture at 70℃ dry bath for 10 minutes, then put on ice for 5 minutes. Add the following contents: 5 × first strand buffer 4 ?l RRI 1 ?l 10 mM dNTP 1 ? l M-MLV (200 U / ?l) 1 ?l DEPC H2O 2 ?l 操作步骤（二） 4. incubate at 37℃ for 1 h. (The total volume should now be 20 ?l) 5. Inactive the reaction by heating at 70℃ for 15 min, then add 20 ?l ddH2O and the first strand of cDNA can be used as a template to amplification in PCR. 6. To remove the RNA complementary to the cDNA, add 1 ?l (2 units) of RNase H and incubate at 37℃ for 20 min. PCR技术 PCR（多聚酶链式反应〕是一种体外扩增特异DNA片段的技术，是分子克隆技术中最常用的技术之一，是在模板DNA、引物和dNTPs的存在下依赖于DNA聚合酶的酶促反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。反应分为变性（denaturation，）退火（annealing）、延伸（extension）三步，经过一定的循环，介于两个引物之间的特异DNA片段得到大量扩增。 The Invention of PCR Invented by Kary Mullis in 1983. First published account appeared in 1985. Awarded Nobel Prize for Chemistry in 1993. 模板DNA：一般102－105个拷贝 Mg2＋：Mg2＋能影响反应的特异性和扩增片段的产率。一般反应体系中1.5-2.5 mmol/L 反应反冲液 ：使Taq DNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。 dNTP：在PCR反应体系中其浓度一般为 20－200 ? mol/L，浓度过高、过低都不利。 Taq DNA聚合酶：在70－75?C具最高活性。具有5’－3’的聚合酶活性和5’－3’的外切酶活性，无校正功能。是镁依赖性酶。 引物：PCR反应中引物浓度一般为0.1－0.5 ? mol/L。 PCR反应体系中的主要成分及其作用： 变性：模板DNA由双链变成单链，使有利于与引物结合。可根据模板的复杂程度调整变性温度和时间，一般情况下94?C 30秒可使各种复杂的DNA分子完全变性（过高的温度或高温持续时间过长，可对Taq DNA聚合酶活性和dNTP分子造成损害）。 退火：变性的DNA快速冷却至40－60?C可使引物和模板DNA发生结合。可根据引物的长度和G