多重连接探针扩增(MLPA)的原理及其应用45.ppt

* Probes for copy number changes and for specific mutations can be combined in one test. (3000 cells / 0.5 ml amniotic fluid). * Probes for copy number changes and for specific mutations can be combined in one test. (3000 cells / 0.5 ml amniotic fluid). * Probes for copy number changes and for specific mutations can be combined in one test. (3000 cells / 0.5 ml amniotic fluid). 98 oC 加热80分钟 98 oC 加热20分钟 98 oC 加热5分钟 由于MLPA探针识别序列仅约70nt，因此可用于DNA碎片的检测，即使长时间的对DNA样品加热导致其断裂也不会对最终检测结果造成大影响。 可检测降解DNA MLPA工作流程 变性 样品DNA在98度下加热5分钟。 杂交 往变性后的样品中加入 SALSA 探针混合液和MLPA 缓冲液。 混合体系在95度下加热1分钟后，在60度下温浴杂交16个小时。 连接 在杂交产物中加入连接酶混合液在54度下温浴连接15分钟 。 98度加热5分钟使连接酶失活。 PCR 加入引物，dNTP和DNA聚合酶。 PCR反应。 毛细管电泳 将扩增片段长度和结果峰导入到excel表中。 分析结果。 杂交 溶液体积: 8 μL 杂交时间 60 °C杂交16小时，即使是延长到20小时也可以。 溶液的盐浓度: 盐浓度在杂交反应中为 350 mM。 杂交温度: 杂交 温度 62 °C会导致杂交探针不稳定；杂交温度 60 °C 会导致杂交速度变慢。 MLPA工作流程 变性 样品DNA在98度下加热5分钟。 杂交 往变性后的样品中加入 SALSA 探针混合液和MLPA 缓冲液。 混合体系在95度下加热1分钟后在60度下温浴杂交16个小时。 连接 在杂交产物中加入连接酶混合液在54度下温浴连接15分钟 。 98度加热5分钟使连接酶失活。 PCR 加入引物，dNTP和DNA聚合酶。 PCR反应。 毛细管电泳 将扩增片段长度和结果峰导入到excel表中。 分析结果。 连接 连接反应 90% 在两分钟之内完成，连接反应在 5 min到25 min都可以。 DNA连接酶的量非常重要 过量的DNA连接酶易造成非特异连接 连接反应中盐浓度降低到75 mM.，由于探针Tm在低盐时会降低, 故连接反应温度降低到54 oC。 连接酶为NAD (Ligation buffer A)和镁离子（ligation buffer B）依赖的，因此，buffers A and B不能反复冻融。 MLPA工作流程 变性 样品DNA在98度下加热5分钟。 杂交 往变性后的样品中加入 SALSA 探针混合液和MLPA 缓冲液。 混合体系在95度下加热1分钟后在60度下温浴杂交16个小时。 连接 在杂交产物中加入连接酶混合液在54度下温浴连接15分钟 。 98度加热5分钟使连接酶失活。 PCR 加入引物，dNTP和DNA聚合酶。 PCR反应。 毛细管电泳 将扩增片段长度和结果峰导入到excel表中。 分析结果。 PCR反应 引物混合液包含了一条荧光标记引物和一条未标记引物和 dNTPs.对于不同的型号的毛细管电泳仪,可能需使用不同荧光标记的通用引物,其中ABI系列的毛细管的电泳仪需使用FAM标记的通用引物，Beckman系列的需使用Cy5.0标记的通用引物。 SALSA DNA聚合酶与Taq DNA聚合酶类似，但浓度更高. 有些探针对DNA酶活性较为敏感，由于 DNA纯度可以影响DNA聚合酶活性，故DNA不纯可以导致部分探针信号较低。要求质控DNA与样本DNA提取方法一致. PCR循环数影响不是很大. PCR终止是由于引物的消耗完. MLPA工作流程 变性 样品DNA在98度下加热5分钟。 杂交 往变性后的样品中加入 SALSA 探针混合液和MLPA 缓冲液。 混合体系在95度下加热1分钟后在60度下温浴杂交16个小时。 连接 在杂交产物中加入连接酶混合液在54度下温浴连接15分钟 。 98度加热5分钟使连接酶失活。 PCR 加入引物，dNTP和DNA聚合酶。 PCR反应。 毛细管电泳 将扩增片段长度和结果峰导入到excel表中。 分析结果。 毛细管电泳 需要将片段大小和峰面积导到Excel中 分析结果 Coffalys