粪便细菌学规范.doc

粪便细菌学检验操作规范 实验室常规检查是细菌培养，沙门氏菌、志贺氏菌、邻单胞菌和气单胞菌、副溶血性弧菌、致泻性大肠杆菌作为实验室常规培养的主要腹泻病原菌。 一 、标本采集与运送： 1．标本采集 （1）标本采集尽可能在发病早期和应用抗菌药物治疗之前。在不同的时间采集2~3份标本可以提高致病菌的分离率。（2）自然排便采集粪便标本时，取有脓血、粘液、组织碎片部分的粪便1～3g。液体粪便则取絮状物，一般取1～3ml，直接装入粪便容器或保存液或运送培养基中送检。（3）直肠拭子采集粪便标本，检查带菌者时可以采取肛拭（棉拭先用保存液或增菌培养基湿润），深入肛门内7~10cm除采样，不能及时接种时，应将标本放入保存液内。 (4)容器应清洁、带盖、广口的（不宜使用纸盒）、送检的标本中不能加入防腐剂。 2． 标本运送 （1）粪便标本应尽快送检，室温条件下不能超过2h。如不能及时送检可加入pH7.0的磷酸盐甘油或转运培养基，但不宜超过24h。使用改良Cary-Blair培养基时，不能运送培养志贺氏菌的标本。（2）直肠拭子采集的标本必须置入运送培养基或GN肉汤中送检，转运时间不宜超过2h。（3）高度怀疑霍乱弧菌感染的标本运送必须符合特殊标本的安全要求。（4）直肠活检标本用粪便容器送检，内盛少量无菌蒸馏水以防止沉淀。 3．标本保存 不能及时检验的标本通常4-6℃保存，用磷酸缓冲盐甘油溶液保存培养沙门氏菌和志贺氏菌的标本，保存培养弯曲杆菌和弧菌的标本，需加CaCl2(100mg/L)。 二、标本镜检 粪便标本直接镜检找到大量多核白细胞，提示侵袭性致病菌感染。如果是由肠道菌群紊乱引起的腹泻，革兰氏染色结果可以提示是酵母菌还是葡萄球菌感染。 2.?革兰氏染色 制备一张薄的粪便涂片，采用常规革兰氏染色方法。镜下观察是否有大量WBCs，成丛的革兰氏阳性球菌，酵母菌。 3.水样粪便的标本，采用悬滴法暗视野（或相差显微镜）镜检，如发现细菌呈穿梭状极活泼的运动，则考虑为弧菌感染。加入O1群霍乱弧菌诊断多价血清或O139血清，显微镜下观察若运动停止则为抑动试验阳性。 采用悬滴法镜检发现投镖式或螺旋式运动的细菌，革兰阴性弧形、S形或螺旋形的小杆菌，提示弯曲杆菌感染。 三、细菌培养及培养基的选择1．腹泻病原菌常规培养 对患者粪便标本进行腹泻病原菌常规培养，包括沙门氏菌、志贺氏菌、致泻性大肠杆菌、邻单胞菌、气单胞菌，致病性弧菌。此外，也包括可引起菌群失调的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和酵母菌。粪便标本至少应接种血平皿、HE（XLD或SS）、EMB（或MAC或中国兰）等培养基。沿海地区还需增加TCBS琼脂培养基。 补充说明：（1）SS培养基对部分志贺氏菌有抑制作用。（2）常用的肠道选择性培养基（如SS等）对气单胞菌、邻单胞菌有抑制作用，初次分离时应接种血平皿和MAC。（3）若用EMB（伊红美兰）、MAC（麦康凯）等培养基培养后，未检出常见致病菌，但感染性腹泻症状明显，可重新采集粪便标本接种GN 肉汤，35℃培养 4-6h，再转种HE（肠道琼脂）等培养基，进一步分离培养。（4）如怀疑沙门氏菌感染，可先用SF肉汤（亚硒酸盐增军液），以提高检出率。（5）正常人体肠道内可以存在金黄色葡萄球菌，因此只有每克粪便细菌数达到105CFU时才有临床意义。（6）气单胞菌能够在常规的鉴别培养基如MAC和EMB上生长，但选择性培养基更有助于检出气单胞菌。选择性培养基：每10ml的BAP（血琼脂平板）培养基加入10mg氨苄西林（BAP-AMP）。（7）邻单胞菌可以在一些常规鉴别培养基如MAC或HE生长，但选择性培养基更有助于检出邻单胞菌。选择性培养基：IBB琼脂（肌醇-亮绿-胆盐琼脂）。 2．腹泻病原菌的增菌培养早期培养物传代培养后使用增菌肉汤培养，能提高低数量菌的检出率。常用增菌液有：GN肉汤：用于沙门氏菌和志贺氏菌的增菌培养，严格保证培养4-6h后即进行传代。SF肉汤：主要用于沙门氏菌的增菌培养，经36℃培养 24h后，接种鉴别培养基进行分离培养。 TT肉汤：主要用于沙门氏菌的增菌培养，但不包括伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌，培养12h后尽快传代。碱性蛋白胨水：主要用于弧菌增菌， 35-37℃培养5-8h后，传代到TCBS平板上培养。 四、培养物鉴定 1、志贺氏菌的鉴定 志贺氏菌属包括4个种即痢疾志贺氏菌（S.dysenteriae）、福氏志贺氏菌（S.flexneri）、鲍氏志贺氏菌（S.boydii）、宋内氏志贺氏菌（S.sonnei）。志贺氏菌血清学分群分为A、B、C、D四群。目前，A群含有15个血清型，B群含有8个血清型（前5个血清型又进一步分为11个亚型），C群含有19个血清型，D群只含有1个血清型。