实验三-离心技术及酶学实验.ppt

实验内容 酶的提取及比活性测定 方法 酶的本质：蛋白质 盐析法 有机溶剂沉淀法 层析法 电泳 酶 原则 制备的原料 初期采用、后期采用方法 影响因素 影响因素 pH：最适pH 温度：低温时酶比较稳定，有机溶剂需预冷 氧化：－SH对某些酶的活性必需，加入还原剂 重金属离子污染：与－SH发生作用而失活：EDTA 蛋白酶的污染，PMSF、DFP 介质的极性和离子强度：疏水 评估指标 酶的纯度－－用比活性代表 定义：单位重量（mg）蛋白样品中所含酶的活性单位 表示方法：每mg蛋白质所具有酶的活性单位 测定方法：①每ml样品中的蛋白质mg数 ②每ml样品中酶的活性单位 酶的活性单位：酶促反应在单位时间（秒、分钟、小时）内生成一定量的产物或消耗一定量的底物所需要的酶量。 酶的回收率 提取纯化过程中杂蛋白逐步去除，同时伴随部分酶的损失。 在保证纯度的前提下，应尽可能提高酶的收率。  加入有机溶剂计算公式 设加入Xml95%乙醇 ※至终浓度30% 30%（B液体积+X）=95%×X X=30%B液体积÷95%-30%=0.462B液体积 ※至终浓度60% 60%（上清液体积+X）－30%上清液体积=95%X X=（60%-30%）上清液体积÷ 95%-60%=0.867上清液体积 [注意事项] 各步加入有机溶剂量要准确。否则会影响整个实验结果。 操作要在低温下进行 加入有机溶剂时要慢慢滴加，充分搅拌，避免局部浓度过高而引起升温和变性。 加入有机溶剂混匀后不宜放置过久，应立即离心。 离心析出的蛋白质沉淀应立即将溶于适量的缓冲液中，以避免酶活力的丧失。 (二)碱性磷酸酶的比活性测定 [原理] 比活性的定义 单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。 通常用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。 用以鉴定酶的纯化程度，是酶提取与纯化成功与否的评价指标之一。 测定样品的比活性必须测定： 每毫升样品中的酶活性单位数。 每毫升样品中的蛋白质毫克数。 磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性 AKP 4-氨基安替比林 磷酸苯二钠 酚 醌衍生物（红色） 铁氰化钾 根据红色的深浅用比色法测定酚的含量。 37℃保温15分钟产生1μg酚者为1个酶活性单位。 [操作步骤] 1.AKP活性单位测定 取试管5支，按下表操作： 2. 蛋白质含量测定  取试管5支，按下表操作 3. 结果处理与分析 结果处理表 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 回顾实验原理（实验讲义第60页）。 混匀，立即置于37 ℃水浴保温15分钟 C1液0.1 B液0.1 A1液0.1 _ _ 测定液 _ _ _ 0.1 _ 酚标准液（0.1mg/ml） _ _ _ _ 0.1 蒸馏水 37℃水浴保温5分钟 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 pH10碳酸缓冲液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 0.04mol/L基质液 C B A 标准管 空白管 试剂（ml） 加0.2M NaOH溶液1ml 加0.3%4-氨基安替比林1ml, 0.5%铁氰化钾溶液2ml，混匀，室温10min，各溶液进行A510测定 计算：酶活性单位/ml=A标本/A标准×C标准（0.1）×稀释倍数 [操作步骤] C B A 标准管 空白管 试剂（ml） 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 考马斯亮蓝试剂 C2液0.1 B2液0.1 A2液0.1 样品 0.1 标准蛋白溶液 0.1 生理盐水 室温5min，各管进行A595测定 计算：样品中蛋白质的含量（μl）=A样品/A标准×C标准×稀释倍数 * 目 录 * 目 录 实验三 离心技术及 酶学实验 概念 生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒(细胞器、生物大分子的沉淀等)以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离的一种技术。沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度，离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备。 第一节 基本原理 离心力 当一个粒子(生物大分子或细胞器)在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“F”由下式定义，即： 相对离心力（RCF） 通常